Тестирование на ВИЧ

Тестирование на ВИЧ

Знание о наличии у себя ВИЧ-инфекции дает человеку возможность воспользоваться самыми современными методами лечения. Поэтому каждому, кто подвергся риску заражения ВИЧ, рекомендуется пройти консультирование и тестирование на ВИЧ. В последние годы тестирование на ВИЧ приобрело громадное клиническое значение, поскольку своевременно начатая ВААРТ способна не только повысить качество жизни, но и существенно продлить саму жизнь. В связи с этим в последнее десятилетие тестированию на ВИЧ стали уделять гораздо больше внимания. Если раньше в тестировании на ВИЧ усматривали ущемление прав обследуемого, то сегодня — в эпоху ВААРТ — медицинский работник обязан доброжелательно советовать пациенту пройти тестирование на ВИЧ, когда это необходимо, чтобы открыть ему путь к оптимальному лечению ВИЧ-инфекции. Иногда тестирование на ВИЧ проводится в интересах третьих лиц; примеры тому — случайная травма иглой, загрязненной кровью пациента с неизвестным ВИЧ-статусом, и тестирование на ВИЧ беременных.

Если у пациента наблюдается заболевание, которое может быть обусловлено ВИЧ-инфекцией, тестирование на ВИЧ позволит подтвердить или опровергнуть подозрения и, таким образом, станет отправной точкой для дальнейшего диагностического поиска или лечения. Как правило, выясняется, что пациент болен ВИЧ-инфекцией уже некоторое время (зачастую несколько лет). Отдельно стоят случаи, в которых есть основания подозревать острую или приобретенную вертикальным путем ВИЧ-инфекцию. Они требуют особого подхода к тестированию (см. ниже).

Тестирование на ВИЧ проводится не только при необходимости обследовать конкретного больного. Оно широко используется для массовых обследований, в том числе доноров крови, препаратов крови и органов. В подобных случаях тестирование на ВИЧ позволяет гарантировать безопасность пациентов, либо используется в целях эпидемиологического надзора (UNAIDS, 1997a и 2001).

Как проводить тестирование

Обычно основанием для диагноза ВИЧ-инфекции служат косвенные признаки, а именно специфические антитела к ВИЧ (Gurtler 1996). Они обнаруживаются фактически у 100% ВИЧ-инфицированных и свидетельствуют о реакции гуморального иммунитета на вирус. В отличие от антител ко многим вирусам, антитела к ВИЧ не обеспечивают ни защиту от ВИЧ, ни иммунитет к ВИЧ-инфекции. Их присутствие лишь означает, что у пациента на протяжении некоторого времени имеется ВИЧ-инфекция. Случаи ВИЧ- инфекции, в которых антитела к ВИЧ стойко не определяются, настолько редки, что пока для клинической практики значения не имеют или почти не имеют (Connick 2005). Возможно, в будущем эта ситуация изменится (Kassutto, 2005).

О наличии ВИЧ-инфекции можно судить не только по косвенным, но и по прямым признакам. К ним относятся: сам ВИЧ (его выделяют в культуре клеток — только в специализированных лабораториях 3 уровня биологической безопасности), антигены ВИЧ (в частности, антиген p24, выявляемый при ИФА) или нуклеиновые кислоты ВИЧ (то есть генетический материал). Последние выявляют при так называемых тестах на РНК или ДНК ВИЧ. Именно они используются сегодня чаще всего, поскольку для их проведения лабораториям не требуется повышенных мер безопасности, они более чувствительны, чем тесты на антигены ВИЧ, и позволяют получить количественные данные.

Прямые качественные тесты на ВИЧ (позволяющие получить ответ «да» или «нет») целесообразно использовать для определения ВИЧ-статуса лишь в отдельных случаях, таких как подозрение на недавнее заражение ВИЧ и обследование детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами (подробнее см. ниже). В то же время прямые количественные тесты на нуклеиновые кислоты ВИЧ имеют гораздо большее значение. В частности, тест на так называемую вирусную нагрузку, то есть тест, с помощью которого определяют концентрацию вирусной РНК в крови, стал незаменимым средством управления антиретровирусной терапией.

Однако следует отметить, что понятие «тест на ВИЧ» (иногда его ошибочно называют тестом на СПИД), как правило, относят к тестам на антитела к ВИЧ — косвенные показатели ВИЧ-инфекции.

Диагностика ВИЧ-инфекции с помощью тестов на антитела к ВИЧ

Чтобы провести тестирование на антитела к ВИЧ, необходимо использовать по крайней мере два разных теста:

1. предварительный тест (скрининг-тест);
2. подтверждающий тест.

В основе большинства скрининг-тестов лежит ИФА (иммуноферментный анализ) или сходные методы (UNAIDS, 1997b). Чтобы свести к минимуму вероятность ложноотрицательного результата, скрининг-тесты должны обладать высочайшей чувствительностью. Иными словами, они должны улавливать антитела с низким сродством к антигенам, которые появляются вскоре после заражения. Кроме того, скрининг-тесты должны определять антитела к ВИЧ разных типов (ВИЧ-1, ВИЧ-2) и групп (ВИЧ-1-N, ВИЧ-1-O, ВИЧ-1-M) (UNAIDS/WHO, 1992 и 1997).

Положительный результат скрининг-теста необходимо подтвердить по крайней мере одним подтверждающим тестом. В ряде стран, например, в Германии и США, в качестве подтверждающего теста используют так называемый иммуноблоттинг или метод иммунофлюоресценции. В других странах (например, в Великобритании) положительный результат скрининг-теста подтверждают разными исследованиями в определенной последовательности по установленному алгоритму. Последний подход ничем не хуже первого и даже имеет ряд преимуществ, среди которых более низкая стоимость и большая объективность (Tamashiro 1993).

Скрининг-тест по методу ИФА

Многие тест-системы для ИФА выпускаются в виде 96-луночных планшетов для микротитрования. Хотя практически все этапы исследования можно выполнить вручную, планшеты позволяют полностью автоматизировать процесс, благодаря чему тестирование многих проб крови становится и безопасным, и экономичным. По сходному принципу сделаны и многие другие тест-системы, которые помещаются в специальные лабораторные приборы, в которых титрование и анализ полностью автоматизированы. Можно выделить несколько вариантов ИФА. Все они основаны на специфической реакции «антиген-антитело». В самых первых (тестах первого поколения) использовался антиген «цельного вируса», который получали в культуре клеток. В современных тестах (тестах второго и последующих поколений) используется смесь рекомбинантных вирусных протеинов или синтетических пептидов, представляющих собой наиболее иммуногенные детерминанты ВИЧ.

Чтобы ИФА выявила имеющийся в крови пациента вирус, используемые в тесте антигены должны соответствовать тем антителам, что могли выработаться в организме пациента к ВИЧ определенного типа (ВИЧ-1, ВИЧ-2) или группы (ВИЧ-1-N, ВИЧ-1-O, ВИЧ-1-M). Так, неверно использовать ИФА на антитела только к ВИЧ-1, чтобы обследовать пациентов, заразившихся ВИЧ-2 в Западной Африке. В то же время, в силу более или менее выраженной способности к перекрестным реакциям, достоверно различить случаи ВИЧ-1- и ВИЧ-2-инфекции способны лишь специальные исследования, о которых иногда необ- ходимо договариваться непосредственно с лабораторией.

В большинстве тест-систем для ИФА вирусный антиген нанесен на так называемую твердую фазу (например, на дно ячейки планшета). В ячейку добавляют сыворотку пациента. Если в ней содержатся специфические антитела к этим антигенам, происходит реакция антиген-антитело. Следующий этап исследования — отмывание. Его задача состоит в том, чтобы удалить все несвязавшиеся с антигеном компоненты сыворотки, в том числе и антитела, которые не смогли распознать вирусные антигены. Связавшиеся с вирусными антигенами антитела выявляют на следующем этапе исследования — при добавлении меченного ферментом конъюгата. В качестве конъюгата выступают связанные с молекулой фермента либо другие антитела, например, козьи антитела к человеческим иммуноглобулинам (антиглобулиновый тест), либо вирусные антигены, причем зачастую те же, что нанесены на твердую фазу (иммунометрический тест или сэндвич-тест — тесты третьего поколения). Преимущество иммунометрических тестов состоит в том, что они выявляют антитела всех классов (в том числе и ранние IgM-антитела, не играющие существенной роли в развитии ВИЧ-инфекции). Оставшийся несвязанным конъюгат вновь отмывают.

На последнем этапе исследования добавляют субстрат. Если конъюгат связался с комплексом антиген-антитело, соединенный с ним фермент воздействует на субстрат, меняя его цвет. Эта реакция сопровождается выделением света, интенсивность которого (оптическая плотность) измеряется. Полученный показатель пропорционален активности антител в образце крови. В каждой тест-системе имеются образы для положительного и отрицательного контроля; оптическую плотность, полученную при их обработке, часто используют в качестве пороговой (то есть такой оптической плотности, которая служит эталоном для определения результатов теста как положительных или отрицательных). Особый вид тестов — конкурентные. Во время таких тестов вместе с образцом крови пациента к твердой фазе добавляют меченные ферментом антитела к ВИЧ. Эти антитела конкурируют с антителами, присутствующими в крови пациента, за антигены. Если в исследуемом образце антитела к ВИЧ отсутствуют, все или почти все меченные ферментом антитела связываются с антигенами, и добавленный субстрат интенсивно окрашивается. И наоборот: чем больше в образце крови пациента содержится специфических антител, тем слабее окрашивается субстрат. Конкурентные методы исследования, как правило, высокоспецифичны.

Каждый метод исследования обладает собственными преимуществами и недостатками. Следовательно, всегда важно знать, каким именно методом проведено тестирование. Так называемые тесты четвертого поколения выявляют и антитела к ВИЧ, и антиген p24, что позволяет сократить так называемый период диагностического окна (см. ниже) (Brust 2000).

Достоверность результатов теста определяется двумя факторами: чувствительностью и специфичностью. Чувствительность означает способность теста давать положительный результат при наличии болезни (в данном случае, при наличии антител к ВИЧ в сыворотке). В свою очередь, под специфичностью пони- мают способность теста давать отрицательный результат в отсутствие болезни (в данном случае, при от- сутствии антител к ВИЧ в сыворотке).

Скрининг-тесты тесты обладают высочайшей чувствительностью (почти 100%), то есть они способны определить малейшую концентрацию антител к ВИЧ, наблюдаемую в самом начале ВИЧ-инфекции. Высокой чувствительностью обеспечивается низкая вероятность ложноотрицательного результата. Иными словами, если пациент инфицирован ВИЧ, то высокочувствительный тест не позволит ошибочно заключить, что ВИЧ-инфекция у него отсутствует. Если для скрининг-теста выбран тест с высокой чувствительностью, то его отрицательный результат через 6 и более месяцев после чреватого заражением контакта позволит с уверенностью сказать, что вероятность инфекции у данного пациента практически равна нулю (Preiser 2000).

Тесты на ВИЧ, которые поступили в продажу после 7 декабря 2003 г., должны отвечать требованиям нового закона Европейского Союза в отношении средств лабораторной диагностики и иметь маркировку CE. В частности, к ним предъявляется такое требование: тест должен дать положительный результат при исследовании 600 ВИЧ-положительных образцов, включая 200 ВИЧ-2-положительных, полученных на разных стадиях ВИЧ-инфекции.

Таким образом, главное качество скрининг-теста на ВИЧ — максимально возможная чувствительность. Он не имеет права дать отрицательный результат при исследовании ВИЧ-положительного образца, поскольку это чревато серьезными последствиями. В то же время, при столь высокой чувствительности специфичность отчасти снижается. На деле это означает, что положительный результат теста может оказаться ложноположительным. То есть тест может показать присутствие антител к ВИЧ в образце, в котором их нет. Это бывает, когда положительную реакцию дает нечто другое, ошибочно принятое за антитела к ВИЧ. Ложноположительные результаты обусловлены активацией иммунной системы по тем или иным причинам (острая вирусная инфекция, беременность, иммунизация или аутоиммунное заболевание). Специфичность современных скрининг-тестов на ВИЧ составляет не менее 99,5%, то есть при исследовании 4 000 ВИЧ-отрицательных образцов они дают не больше 20 ложноположительных результатов.

Поскольку любой тест может дать неспецифическую ложноположительную реакцию, положительный результат скрининг-теста предпочтительно называть «реактивным». Это нужно, чтобы ложноположительный результат не воспринимался как окончательное лабораторное заключение и все реактивные результаты обязательно проверялись подтверждающими тестами. «Положительным» можно называть только подтвержденный реактивный результат тестирования на ВИЧ!

Внимание! Реактивный результат скрининг-теста не означает, что пациент ВИЧ-инфицирован! Только положительный результат подтверждающего теста является основанием для диагноза ВИЧ-инфекции и, теоретически, только его следует сообщать пациенту!

Среди причин ложноположительных (и ложноотрицательных) результатов тестов на ВИЧ — ошибки, допущенные либо в лаборатории, либо до отправки образцов в лабораторию, либо после получения результатов. Случается, что образцы путают или материал из одного образца попадает в другой из-за погрешностей в ходе исследования, но возможны и чисто канцелярские ошибки (при маркировке пробирок, заполнении направлений в лабораторию, вводе данных в базу лаборатории или клиники). Следовательно, обеспечение качества лабораторных исследований требует пристального внимания даже к таким, казалось бы несущественным, деталям!

Подтверждающий иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг — наиболее часто используемый метод подтверждения реактивных результатов скрининг-тестов. Чтобы получить тест-полоски для иммуноблоттинга, ВИЧ поселяют в культуру клеток, инкубируют, очищают и денатурируют (расщепляют на части). Затем с помощью электрофореза вирусные протеины-антигены разделяют в соответствии с их молекулярным весом и наносят на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на ленты. Чтобы провести тест, сыворотку пациента инкубируют с мембраной. Если в сыворотке имеются антитела к тем или иным нанесенным на мембрану вирусным антигенам, они оседают на соответствующие участки мембраны. Чтобы выявить образовавшиеся комплексы антиген-антитело, используют меченые ферментами антитела с соответствующим субстратом. В результате на мембране появляются так называемые полосы.

Антигены ВИЧ и соответствующие им полосы мембраны для иммуноблоттинга обозначают как «p» (протеин) или «gp» (гликопротеид). За обозначением указывается молекулярная масса (умноженная на 1000). Все эти антигены можно разделить на три группы (в качестве примера взят иммуноблоттинг на ВИЧ-1): Env — гликопротеиды внешней оболочки (gp41, gp120, gp160), Gag — капсидные белки (p18, p24/25, p55) и Pol —протеины обратной транскриптазы, протеазы и интегразы (p34, p40, p52, p68).

Иммуноблоттинг, будучи подтверждающим тестом, проводится только при получении реактивного результата скрининг-теста. В продаже имеются наборы для иммуноблоттинга на ВИЧ-1 и на ВИЧ-2. Результат иммуноблоттинга может быть положительным, отрицательным или сомнительным (неполный набор полос). Последний может свидетельствовать о пограничных или неспецифических реакциях.

Критерии положительного результата иммуноблоттинга различаются в зависимости от организации, которая их разработала. Так, «Американский Красный Крест» определяет результат иммуноблоттинга как положительный при появлении хотя бы одной полосы каждой группы (одной полосы группы Gag, одной — группы Pol и одной — группы Env). Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) установило следующие критерии положительного результата иммуноблоттинга: полосы p24, p34 и gp41 (или gp120/160) (Centers for Disease Control and Prevention, 1989). В соответствии с рекомендациями ВОЗ, счесть результат иммуноблоттинга положительным позволяет наличие двух полос группы Env. В Германии нормативом 58969 часть 41 Немецкого нормативного института установлено следующее правило (Deutsches Institut fur Normung, 2000): образец сыворотки ВИЧ-положителен, если он взаимодействует хотя бы с одним вирусным гликопротеидом и одним протеином. При любом другом наборе полос результат иммуноблоттинга считается сомнительным.

Среди недостатков иммуноблоттинга — высокая стоимость, относительная сложность методики исследования и неизбежная субъективность при считывании и толковании результатов. В связи с этим многие страны предпочли разработать специальные алгоритмы подтверждения результатов. В них указано, при каких обстоятельствах следует использовать те или иные сочетания методов ИФА или экспресс-тестов с известными чувствительностью и специфичностью.

Чтобы поставить диагноз ВИЧ-инфекции, необходимо не только провести подтверждающие тесты (на- пример, иммуноблоттинг), но и обязательно исследовать еще один — полученный в другое время — об- разец крови. По возможности, сообщать пациенту диагноз следует только после тестирования второго образца крови.

Экспресс-тесты

Сегодня выпускается множество экспресс-тестов на ВИЧ. Они известны как «тест на месте», «тест у постели больного» и «упрощенный экспресс-тест». В их основе лежит один из четырех методов: реакция агглютинации, ИФА на полимерных мембранах (тест-полоски), иммунологический фильтрационный анализ либо иммунохроматография (Giles 1999, Branson 2000). Большинство таких тестов позволяет получить результат через 15-30 минут. Многие предназначены для исследования цельной или капиллярной крови (из кончика пальца или мочки уха), что исключает существующую при исследовании венозной крови необходимость центрифугировать образец.

Во многих экспресс-тестах имеется «встроенный» контроль, то есть контрольная полоса, показывающая, верно ли нанесены кровь и реагенты (когда они есть). Если контроль свидетельствует об ошибке, резуль- тат теста считается недействительным (важно не получить ложноотрицательный результат, который возможен, например, когда кровь не нанесена или результат считан раньше времени).

Подобные экспресс-тесты полезны, когда результат необходимо получить быстро, например, в приемном отделении, перед срочными хирургическими вмешательствами или после случайной травмы иглой. Кроме того, они позволяют сократить частоту «невостребованности» результатов тестирования, ведь при получении результата теста через несколько дней некоторые пациенты не обращаются за ним. Поскольку экспресс-тесты просты в исполнении и не требуют сложного оборудования, они служат хорошим подспорьем для развивающихся стран (Branson 2003; WHO 2004). Тем не менее, такие тесты должны отвечать всем основным требованиям, предъявляемым к скрининг-тестам на основе ИФА (WHO/UNAIDS 1998). Теоретически, в развитых странах экспресс-тесты должны использоваться только в качестве ориентировочных, и после них пациентам следует как можно скорее пройти полноценное лабораторное тестирование. Основной проблемой применения экспресс-тестов (помимо потребности в обучении персонала) является необходимость консультировать пациента перед тестированием и получать его согласие на проведение теста. Кроме того, любой тест на ВИЧ, доступный непрофессионалам, может использоваться неправомерно (скажем, для принудительного тестирования заключенных).

В настоящее время в Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США лицензированы несколько новых экспресс-тестов на ВИЧ: OraQuick® (OraSure Technologies, Пенсильвания, США), Reveal™ (MedMira Laboratories, Галифакс, Новая Шотландия), Uni-Gold Recombigen™ (Trinity Biotech, Ирландия) и одноразовая диагностическая система Murex. Недавно, после ряда настораживающих ошибок (было установлено, что по крайней мере у пяти ВИЧ-инфицированным реактивный результат экспресс-теста был расценен как ложноположительный, и им сообщили, что у них нет ВИЧ- инфекции!) Центры контроля и профилактики заболеваний (CDC) указали на необходимость проверять результаты экспресс-тестов качественными подтверждающими тестам, а при необходимости и контрольными тестами через 4 недели (CDC 2004).

Материал для тестирования

Как правило, в тестах на антитела к ВИЧ исследуют сыворотку, плазму, обработанную ЭДТА, и — иногда — цельную кровь. Если исследование проводится не сразу, из образцов плазмы или сыворотки желательно удалить эритроциты, поскольку гемолиз препятствует проведению некоторых тестов.

Иммуноглобулины можно определить даже в мазке крови, высушенном на фильтровальной бумаге. Исследование таких сухих мазков на антитела к ВИЧ используют для массовых (анонимных и не позволяющих идентифицировать личность) обследований беременных и родильниц. В подобных случаях используют стандартные тест-карточки для поголовного исследования новорожденных на фенилкетонурию по методу Гатри (содержание антител в крови новорожденного отражает таковое в крови его матери). Приготовление сухих мазков — удобный и недорогой способ получения материала для исследования в развивающихся странах при недостатке холодильных установок и транспорта. Полностью высушенная кровь перестает быть источником инфекций, даже ВИЧ-инфекции.

Для некоторых тестов используют мочу или мазок из полости рта (иногда его называют слюной, но это неверно, поскольку материалом для исследования служит отделяемое слизистой) (Tamashiro 1994; King 2000). Экспресс-тест мазка из полости рта был лицензирован Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США в марте 2004 г., в нем используется та же технология, что и в тесте, поставляемом на рынок OraSure Technologies, который в ноябре 2002 г. был лицензирован в ка- честве экспресс-теста на антитела к ВИЧ в цельной крови (см. выше). По имеющимся данным, этот тест определяет антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с чувствительностью 99,3% и специфичностью 99,9 %.

В определенных обстоятельствах моча и мазок из полости рта — единственно возможные материалы для тестирования, поскольку, в отличие от образцов крови, их получение не требует инвазивного вмешатель- ства. Однако чувствительность и специфичность тестов, которые проводятся мочой и мазком из полости рта, по большей части невелики. Таким образом, кровь остается главным материалом для тестирования. Важно помнить, что реактивный результат теста на любом материале, безусловно, должен проверяться подтверждающим тестом.

Характеристики теста

Тесты на антитела к ВИЧ — одни из самых лучших коммерческих иммунологических тестов. Наиболее важными их характеристиками являются чувствительность (высокая чувствительность -> мало ложноотрицательных результатов) и специфичность (высокая специфичность -> мало ложноположительных результатов). У каждого теста они свои и рассчитываются отдельно. Однако наибольший практический интерес представляют не чувствительность и специфичность теста, а предсказательная ценность его результатов. Это объясняется тем, именно результаты теста должны позволить нам определить ВИЧ-статус пациента. Предсказательная ценность положительного результата — это вероятность того, что пациент с положительным результатом теста действительно инфицирован. И наоборот: предсказательная ценность отрицательного результата — это вероятность того, что пациент с отрицательным результатом теста и в самом деле не инфицирован.

В таблице 1 представлена связь между характеристиками:
Чувствительность
= число положительных результатов / (число положительных результатов + число ложноотрицательных результатов)
= вероятность положительного результата при наличии инфекции
Специфичность
= число отрицательных результатов / (число отрицательных результатов + число ложноположительных результатов)
= вероятность отрицательного результата в отсутствие инфекции
Предсказательная ценность положительного результата
= число положительных результатов / (число положительных результатов + число ложноположительных результатов)
= вероятность наличия инфекции при положительном результате теста
Предсказательная ценность отрицательного результата
= число отрицательных результатов / (число отрицательных результатов + число ложноотрицательных результатов)
= вероятность отсутствия инфекции при отрицательном результате теста

На первый взгляд это может показаться невероятным, и тем не менее предсказательная ценность результатов теста зависит не только от его чувствительности и специфичности, но и от распространенности ВИЧ-инфекции в данной популяции (то есть от исходной вероятности иметь соответственно положительный или отрицательный ВИЧ-статус). Эта зависимость показана на рис. 1 на примере воображаемой популяции с долей серопозитивных по ВИЧ лиц от 0,02 % (например, доноры крови в европейской стране) до 20 % (например, группа сексуально активного населения в стране с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции). На рис. 1 видно, что при низкой распространенности ВИЧ-инфекции (0,02%) преобладающее большинство положительных (или, точнее, реактивных) результатов теста в действительности ложноположительны: инфицированными оказываются лишь 4.8% лиц, получивших положительный результат теста!

Напротив, в группе с высоким риском ВИЧ-инфекции (распространенность 20%) 98% положительных результатов теста действительно положительны. Именно поэтому в рекомендациях ВОЗ указано, что при высокой распространенности ВИЧ-инфекции подтверждать положительные результаты скрининг-тестов не обязательно. Представленные примеры показывают, насколько важно верно выбрать тактику подтверждения положительных результатов скрининг-тестов!

К сожалению, описанный статистический феномен нередко используют в пропагандистских целях. Скажем, в популяции доноров крови в Германии, где распространенность ВИЧ-инфекции мала, действительно положительными будет лишь небольшая часть реактивных результатов скрининг-тестов. Для обследуемых это не должно было бы иметь существенного значения, поскольку в любом случае реактивный результат скрининг-теста проверяется и, когда иммуноблоттинг его не подтвердит, пациенту (или донору крови) просто должны были бы сообщить, что его ВИЧ-статус не является положительным! Тем не менее, как ни печально, расхождения между действительно положительными и ложноположи- тельными результатами часто используют в качестве «доказательства» мнимой пользы тестов на ВИЧ.

Рисунок 1. Зависимость предсказательной ценности положительного результата от доли серопозитивных лиц в исследуемой популяции при использовании теста с постоянной специфичностью 99,6% (4 ложноположительных результата на 1000 исследованных образцов).

Когда проводить тестирование?

С момента заражения до тех пор, пока в результате иммунного ответа в крови ВИЧ-инфицированного появится такое количество антител, которое может быть выявлено, обычно проходит от 3 до 12 недель. В связи этим не следует проводить тестирование вскоре после опасного заражением контакта даже если пациент по вполне понятным причинам обеспокоен и требует обследования. Однако при профессиональном контакте тестирование необходимо выполнить немедленно — это необходимо, чтобы убедиться, что подвергшийся риску заражения медицинский работник изначально серонегативен! Примерно у 5% лиц с момента заражения до появления в крови определимого титра антител проходит более 2 месяцев. Следовательно, следующий тест можно назначить на более поздний срок.

Вероятность приобрести ВИЧ-инфекцию возрастает, если хотя бы на один из приведенных ниже вопросов пациент может ответить утвердительно.

• Вступали ли вы в половые отношения с ВИЧ-инфицированным партнером без презерватива?
• Имелись ли у вас ранее инфекции, передающиеся половым путем, такие как хламидиоз или гонорея?
• Пользовались ли вы теми же шприцами или иглами (общими иглами), что и другие потребители наркотиков?
• Делали ли вам переливание крови или ее препаратов в период с 1978 г. по 1985 г?
• Вступали ли вы в половой контакт с кем-либо, кто мог бы ответить «да» на приведенные выше во- просы?

Сегодня все чаще говорится о том, что тестирование на ВИЧ необходимо «лишить особого статуса» (Manavi et al., 2005; Beckwith et al., 2005). Установлено, что с распространением эпидемии за пределы групп риска многие случаи ВИЧ-инфекции могут быть упущены, а дополнительная нагрузка, связанная с необходимостью проводить полноценное предтестовое консультирование, может стать препятствием к тому, чтобы медицинские работники предлагали пациентам пройти тестирование.

Проблема «диагностического окна»

Одна из важнейших проблем тестирования на ВИЧ —так называемый период диагностического окна. Это срок, который проходит с момента заражения ВИЧ до появления определимого уровня антител (Busch 1997). Переход неопределимого титра антител в определимый называется сероконверсией. Современные скрининг-тесты выявляют ВИЧ-инфекцию через 6 недель после заражения примерно в 80% случаев, а через 12 недель — почти в 100% случаев. Крайне редко ВИЧ-инфекция выявляется только через 3-6 месяцев после заражения. Чтобы сократить период диагностического окна, в скрининг-тестах четвертого поколения определяются и антитела к ВИЧ, и антиген p24 (Gurtler 1998, Ly 2001). Однако у тестов такого рода есть свои сложности: они раньше становятся положительными, но в силу методологических причин (Meier 2001) они дают второй период окна, то есть спустя некоторое время их результаты становятся отрицательными.

На ранних этапах сероконверсии скрининг-тесты дают пограничный или слабоположительный результат. Используемый для подтверждения иммуноблоттинг в этот период может не дать ни одной полосы, либо показать неполный набор полос, причем полоса p24 часто проявляется первой. Результаты тестирования в подобных случаях нередко неотличимы от результатов, получаемых у неинфицированных лиц при наличии так или иначе выраженных неспецифических реакций — у них иногда тоже проявляется только полоса p24. Это ясно показывает, насколько важно сообщать в лабораторию, которая выполняет тест, все важные клинические данные (например: «подозревается недавнее заражение», «стандартный скринингтест» и так далее).

Прояснить ситуацию в подобных случаях порой не удается на протяжении некоторого времени, но контрольные исследования достаточно скоро расставляют все по местам. Если сомнительный результат получен в начале сероконверсии, уже в ближайшее время реактивность сыворотки возрастет и через несколько недель иммуноблоттинг даст полный набор полос. Целесообразность применения в начале сероконверсии прямых тестов на ВИЧ (например, ПЦР), в каждом случае зависит от обстоятельств. Важно помнить, что антиретровирусная постконтактная профилактика влияет на результаты таких тестов и может отдалить сероконверсию.

Постепенное нарастание реактивности сыворотки в ходе сероконверсии можно использовать в целях эпидемиологической диагностики. Так называемая стратегия тестирования «со снижением чувствительности» позволяет оценивать заболеваемость — то есть частоту новых случаев инфекции. Она в корне отличается от распространенности (частоты всех выявляемых случаев ВИЧ-инфекции), которую определяют стандартные тесты на антитела к ВИЧ. Продуманно комбинируя высокочувствительные тесты на антитела к ВИЧ с менее чувствительными, можно определить, какая доля положительных результатов получена у людей, недавно заразившихся ВИЧ (Parekh 2001; Constantine et al. 2003).

Прямые тесты на ВИЧ

Диагноз ВИЧ-инфекции можно поставить не только на основании косвенных признаков (наличия антител к ВИЧ), но и на основании прямых доказательств присутствия вируса. Непосредственно выявлять ВИЧ требуется лишь в некоторых случаях и только по показаниям, поскольку стоимость тестов, которые позволяют это сделать, высока.

Выделение вируса в культуре клеток — исследование, которое приберегают для особых случаев: оно требует специального оборудования и подготовки, а кроме того сопряжено с определенным риском и поэтому может проводиться только в лабораториях с повышенными мерами безопасности.

Существуют и другие прямые тесты на ВИЧ, в частности тест на антиген p24. В целом ИФА на антиген p24 сегодня вытеснили более чувствительные тесты на нуклеиновые кислоты ВИЧ, однако скринингтесты четвертого поколения помимо антител к ВИЧ выявляют и антиген p24, что позволяет сократить период диагностического окна (см. выше).

Вирусные нуклеиновые кислоты (то есть генетический материал ВИЧ) можно определить различными лабораторными методами. Одни из них выявляют провирусную кДНК в лейкоцитах (в цельной крови, обработанной ЭДТА), другие — вирусную РНК в бесклеточной фракции (в плазме или цельной крови, обработанной ЭДТА).

Качественные тесты на нуклеиновые кислоты ВИЧ позволяют судить о наличии инфекции. Они дополняют или заменяют тесты на антитела к ВИЧ при диагностике ВИЧ-инфекции в отдельных случаях — например, при подозрении на недавнее заражение (в период диагностического окна, когда антитела не определяются) или при обследовании детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами (в их крови присутствуют материнские антитела — см. ниже)

Количественные тесты на РНК ВИЧ в плазме позволяют составить прогноз, следить за результатами лечения и оценивать вирулентность (Berger 2002). Наиболее чувствительные количественные тесты определяют РНК ВИЧ в концентрации около 50 копий/мл.

Для выявления генетического материала ВИЧ существует множество коммерческих тестов и тестов «домашнего применения». В их основе лежат различные методики: полимеразная цепная реакция (ПЦР), метод разветвленной ДНК, метод амплификации, основанной на нуклеотидной последовательности, или лигазная цепная реакция. Исследование так называемой вирусной нагрузки сегодня в клинической практике незаменимо: оно позволяет как оценивать прогноз, так и следить за эффективностью лечения.

Результаты теста

Ложноположительный результат иммуноблоттинга — чрезвычайная редкость. В связи с этим положительный результат иммуноблоттинга подтверждает наличие специфических антител к ВИЧ и — следовательно —ВИЧ-инфекции.

О положительном результате тестирования говорят, когда скрининг-тест и подтверждающий тест дали положительные результаты, а вероятность ошибки при идентификации исследуемых образцов была исключена взятием другого образца. Положительный результат тестирования на ВИЧ означает, что обследованный:

• инфицирован ВИЧ, то есть в его организме присутствует вирус, являющийся причиной СПИДа (исключение — маленькие дети; см. ниже);
• способен передать ВИЧ другим людям, если не будут приняты меры предосторожности (см. гл. о передаче ВИЧ).

Положительный результат тестирования на ВИЧ НЕ означает, что обследованный пациент:

• болен СПИДом;
• обязательно заболеет СПИДом.

Отрицательный результат тестирования на ВИЧ означает, что:

• в крови обследованного на момент проведения исследования антитела к ВИЧ не определялись.

Отрицательный результат тестирования на ВИЧ НЕ означает, что обследованный:

• не инфицирован ВИЧ (тестирование могло проводиться в период диагностического окна);
• обладает иммунитетом или устойчивостью к ВИЧ;
• может вступать в половые отношения, не соблюдая правил безопасного секса.

По истечении периода диагностического окна (через 6 и более месяцев после чреватого заражением контакта) скрининг-тесты на ВИЧ редко дают ложноотрицательный результат. Следовательно, отрицательный результат тестирования на этом этапе означает, что обследуемый не инфицирован ВИЧ — при условии, конечно, что за это время риску заражения ВИЧ он более не подвергался.

«Сомнительный» результат подтверждающего теста встречается редко. Что он означает?

• Тест не дал однозначного результата. Следовательно, в ближайшем будущем необходимо провести контрольное тестирование. Подозревать острую лихорадочную стадию ВИЧ-инфекции и начало сероконверсии прежде всего заставляют такие клинические проявления, как лихорадка, увеличение лимфоузлов, сыпь и неврологические нарушения. Иногда тест на антитела реакцию дает, а при иммуноблоттинге полный набор полос еще не определяется. Сероконверсия следует определенной ди- намике, и при иммуноблоттинге одни полосы (например, p24 или gp120) проявляются раньше, а другие — позже.
• Если результат иммуноблоттинга сомнителен, но клиническая картина или данные анамнеза заставляют подозревать острую фазу ВИЧ-инфекции, следует провести прямое исследование на ВИЧ — ПЦР. Это необходимо, чтобы своевременно выявить и, возможно, начать лечить ВИЧ-инфекцию (см. также гл. «Острая лихорадочная фаза ВИЧ-инфекции»). Чем раньше, тем лучше!

Внимание! Если при подозрении на недавно приобретенную ВИЧ-инфекцию используется количественный тест на РНК ВИЧ в плазме (он часто доступнее ПЦР на провирусную кДНК в лейкоцитах), важно помнить о вероятности ложноположительного результата (Rich 1999). В подобных случаях вирусная РНК как правило определяется в низкой концентрации (обычно не более 2000 копий/мл), что в острой фазе ВИЧ-инфекции маловероятно, поскольку для нее характерна высокая вирусная нагрузка. Как бы то ни было, ложноположительные результаты тестов на вирусную нагрузку порой вносят путаницу и приводят к ошибочному диагнозу.

Вероятность ошибки существует при использовании любого теста на вирусную нагрузку. Если упустить это из вида, не инфицированный пациент будет признан инфицированным, что чревато многочисленными пагубными последствиями. Не допустить подобной ошибки (безошибочное соблюдение методики теста и соответствующий контроль качества исследований в лаборатории мы не обсуждаем) позволяет тест на провирусную кДНК в лейкоцитах, который, однако, выполняют в относительно редкие лаборатории.

Особый случай: дети, рожденные ВИЧ-инфицированными женщинами

К счастью, риск передачи ВИЧ от матери ребенку (ПМР) (см. гл. о ВИЧ-инфекции и беременности) в развитых странах весьма сократился и, по-видимому, сегодня не превышает 1%. Тем не менее, проводить диагностику ВИЧ-инфекции необходимо всем новорожденным, чьи матери инфицированы ВИЧ! У детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами, антитела к ВИЧ в норме определяются примерно до 12-15 мес. Это пассивно приобретенные антитела, которые проникали в кровь плода через плаценту начиная примерно с 30-й недели внутриутробного развития. Материнские IgG-антитела обеспечивают ребенку более или менее выраженный иммунитет ко многим инфекциям, однако против ВИЧ они бессильны. Таким образом, у всех детей, рожденных ВИЧ-инфицированными женщинами, в том числе и у не инфицированных (их всегда большинство), тесты на антитела к ВИЧ изначально дают положительный результат. Однако со временем реактивность сыворотки снижается и, как только материнские антитела из крови не инфицированного ВИЧ ребенка исчезнут, тесты на антитела к ВИЧ становятся отрицательными.

Раньше диагностика ВИЧ-инфекции у новорожденных занимала очень много времени и требовала регулярных повторных исследований крови. Чтобы достоверно исключить ВИЧ-инфекцию у ребенка, обычно приходилось ждать 9 или больше месяцев, пока титр антител к ВИЧ в крови ребенка не упадет (Newell 1995). Если антитела к ВИЧ сохранялись в крови рожденного ВИЧ-инфицированной женщиной ребенка после того, как ему исполнялось 15 месяцев, ему ставили диагноз ВИЧ-инфекции.

Сегодня поставить диагноз ребенку можно раньше — с помощью ПЦР. Убеждаться в присутствии или (как мы всегда надеемся) в отсутствии вируса в крови ребенка необходимо с помощью прямых тестов на ВИЧ. Пока не ясно, какой из двух методов более чувствителен: определение провирусной (внутриклеточной) кДНК в лейкоцитах или же вирусной РНК (внеклеточной) в плазме. В любом случае, каждый положительный результат теста необходимо подтверждать исследованием другого образца.

Внимание! Многие тесты на нуклеиновые кислоты ВИЧ не чувствительны, если инфекция вызвана «экзотическими» штаммами ВИЧ: ВИЧ-1 не подтипа B и ВИЧ-2. В подобных случаях они дают ложноотри- цательный результат (Haas 1996). Чтобы исключить такую вероятность, при необходимости (например, если мать или лицо, от которого она заразилась ВИЧ, — не европейцы) тест проводят с кровью матери. Это позволяет установить, способен ли используемый тест определить данный штамм ВИЧ. Если ПЦР при исследовании материнской крови дала положительный результат, отрицательный результат ПЦР при исследовании крови ребенка можно считать достоверным. В противном случае кровь ребенка необходимо исследовать чувствительным к редким штаммам ВИЧ методом в специализированной лаборатории, либо прибегнуть к тестам на антитела к ВИЧ со всеми упомянутыми оговорками (см. выше).

Исключить ВИЧ-инфекцию у ребенка, рожденного ВИЧ-инфицированной женщиной, позволяют лишь два отрицательных результата ПЦР: один должен быть получен в возрасте от 1 до 4 месяцев, другой — в возрасте старше 4 месяцев. Только в таком случае можно уверенно утверждать, что у ребенка ВИЧ- инфекция отсутствует (Rossi 1992). Кроме того, ПЦР детям проводят раньше — до месячного возраста (но не в первые дни жизни, поскольку можно случайно определить материнский вирус). Это необходимо, поскольку ранняя диагностика ВИЧ у новорожденного позволяет начать профилактику пневмоцистной пневмонии и антиретровирусную терапию в первые месяцы жизни ребенка. Если первая же ПЦР положительна (и результат был подтвержден), ребенок был инфицирован внутриутробно (встречается реже). При передаче ВИЧ во время родов (именно так бывает чаще всего) обнаружить вирус удается только более поздним исследованиям. Внимание! При естественном вскармливании риск передачи ВИЧ от матери ребенку весьма высок, и все сказанное относится только к случаям, в которых передача ВИЧ в послеродовом периоде исключена.

Чтобы убедиться в отсутствии ВИЧ-инфекции у ребенка, рожденного ВИЧ-инфицированной женщиной, помимо отрицательных результатов ПЦР необходимо получить хотя бы один отрицательный результат теста на антитела к ВИЧ в возрасте, когда материнские антитела полностью элиминируются.

Особый случай: травма иглой и прочие контакты, чреватые заражением ВИЧ на рабочем месте

В данном случае возникают две проблемы: тестирование пациента, который может быть источником инфекции (источника или донора), и тестирование медицинского работника, подвергшегося риску заражения (пострадавшего или реципиента). Безусловно, по юридическим и прочим соображениям, решать эти проблемы необходимо в соответствии с национальными и местными нормативами.

Если источник известен, его (после соответствующего консультирования и получения согласия) необходимо обследовать. Теоретически, следует немедленно вызвать начальника пострадавшего, чтобы он отдал распоряжение о тестировании источника на антитела к ВИЧ, HBsAg (не следует забывать об иммунизации против гепатита B при необходимости) и антитела к вирусу гепатита C. Иногда (например, в выходной день) можно провести экспресс-тесты. Предварительное решение о ведении пострадавшего следует принять еще до получения результатов тестирования источника, поскольку любая проволочка сокращает вероятность успеха постконтактной профилактики ВИЧ-инфекции (ПКП) (CDC 2001). Следовательно, при малейшем риске заражения медицинский работник должен принять первые одну или две дозы по схеме ПКП (так называемый начальный набор ПКП должен быть доступен днем и ночью), если же результат тестирования источника окажется отрицательным, профилактику следует прекратить. Начинать ПКП только после получения положительного результата тестирования источника — ошибка, поскольку в этом случае медицинский работник получит первую дозу ПКП, когда время ее наибольшей профилактической эффективности уже будет упущено!

Если источник серонегативен и какие-либо симптомы острой лихорадочной фазы ВИЧ-инфекции у него отсутствуют, вероятность того, что он находится в периоде диагностического окна крайне мала. Следовательно, отказаться от прямых тестов на ВИЧ (чтобы исключить недавно приобретенную инфекцию) в такой ситуации вполне оправдано. Если источник неизвестен, следует ориентироваться на эпидемиологические данные. Внимание! Искать антитела к ВИЧ в крови с использованных инъекционных игл и прочих инструментов в целом не рекомендуется: затраты сил и денег и — прежде всего — сомнительность результатов слишком велики, учитывая крайне низкий риск передачи столь, к счастью, нестойкого во внешней среде вируса.

Если источник ВИЧ-позитивен, для выбора метода ПКП (см. соответствующую гл.) необходимо собрать и учесть все сведения о нем (в том числе вирусную нагрузку в настоящее время, результаты тестов на лекарственную устойчивость ВИЧ и так далее).

При положительных результатах тестирования на ВИЧ источника пострадавшему необходимо сразу же провести стандартный скрининг-тест на антитела к ВИЧ. Подтвердить его серонегативный статус важно с юридической точки зрения — он станет основанием для подачи заявления на компенсацию и выплату страховки в связи с заражением на рабочем месте. Контрольные тесты рекомендуется проводить через 6 недель, 3 месяца и 6 месяцев после чреватого заражением контакта (Ciesielski, 1997). Если источник инфицирован ВИЧ, еще одно контрольное обследование пострадавшего проводят через 12 месяцев после контакта, в остальных случаях это не обязательно (Ridzon 1997). Кроме того, если у источника появятся симптомы острой лихорадочной фазы ВИЧ-инфекции, тест на антитела к ВИЧ (и, возможно, прямой тест на ВИЧ) следует провести безотлагательно, независимо от срока, прошедшего после контакта.

Практические сведения

При проведении любого теста на ВИЧ необходимо принимать во внимание целый ряд факторов. Как ни печально, но легкомыслие и небрежность в данной области встречаются и поныне.
О чем важно помнить?
Несмотря на достижения в лечении ВИЧ-инфекции, положительный результат теста на ВИЧ по-прежнему чреват тяжелейшей психологической травмой для того, кто его получил. Его неблагоприятные последствия зачастую переоценивают.

В связи с этим каждому пациенту следует сообщать, что ему будет проведено тестирование на ВИЧ. Делать это необходимо заранее! Тестирование в рамках стандартного обследования перед хирургическим вмешательством, которое до сих пор иногда проводят, тем более, если оно даст положительный результат чревато не только неприятными психологическими, но порой и серьезными юридическими последствиями для персонала. Согласие на тестирование не обязательно получать в письменной форме, однако его обязательно регистрировать в истории болезни. Если речь идет о ребенке или недееспособном пациенте, информировать о предстоящем тестировании на ВИЧ следует родителей или официальных доверенных лиц.

Получить согласие на тестирование важно, но с другой стороны, при этом отнюдь не всегда следует подробно разъяснять пациенту все факторы риска, последствия и так далее. Предтестовое консультирование должно соответствовать обстоятельствам каждого конкретного случая. Пациента необходимо оберегать от неоправданных тревог и психических травм.

Сообщать результаты тестирования на ВИЧ должны только те врачи, которые сами хорошо осведомлены в вопросах ВИЧ-инфекции и СПИДа или знают, куда безотлагательно направить пациента с только что установленным диагнозом ВИЧ-инфекции. Люди, впервые столкнувшиеся с таким диагнозом, нуждаются в интенсивной поддержке, причем немедленно! Порой пациентам сообщают устаревшую информацию, и в результате выйти на необходимых специалистов им удается лишь спустя недели и даже месяцы. Положительный результат тестирования на ВИЧ ни в коем случае нельзя сообщать по телефону.

Во-первых, во время телефонного разговора невозможно провести полноценное послетестовое консультирование. Во-вторых, не видя пациента, нельзя оценить его реакцию, тогда как столь тяжелое известие способно толкнуть человека на самоубийство. Порой сообщение диагноза провоцирует серьезные психические нарушения или бурную эмоциональную реакцию, что требует послетестового консультирования в расширенном объеме. В каждом случае реакция непредсказуема. По возможности, договариваться о встрече с пациентом следует при взятии у него материала для исследования. Отрицательный результат тестирования по телефону сообщать допустимо.

По указанным причинам, использование экспресс-тестов для самостоятельного применения связано с серьезными недостатками. Так называемые «тесты на месте» и «тесты у постели больного» в определенных обстоятельствах весьма полезны (в частности в приемных отделениях), однако за ними скрываются такие проблемы, как непрофессиональное применение без должного консультирования и помощи пациенту.

Сообщать пациенту положительный (реактивный) результат скрининг-теста до того, как он будет проверен, не следует ни при каких обстоятельствах! Поскольку по многим причинам результат скрининг-теста может оказаться ложноположительным, всегда необходимо дождаться результата подтверждающего теста. Неполный набор полос при подтверждающем иммуноблоттинге может свидетельствовать как о начале сероконверсии (то есть о недавнем заражении), так и о неспецифической реакции иммунитета. Такие результаты всегда необходимо сначала обсудить с лабораторией и опытным специалистом по диагностике ВИЧ-инфекции и только затем сообщать пациентам. Мы встречали пациентов, которые по нескольку дней и даже недель пребывали в уверенности, что они ВИЧ-инфицированны, лишь потому, что медицинские работники, не дождались результата подтверждающего теста и сообщили о положительном результате ИФА, хотя он был обусловлен перекрестными реакциями.

Даже после подтверждения серопозитивного ВИЧ-статуса иммуноблоттингом и получения первого подтвержденного положительного результата тестирования следует напомнить себе: «Наличие специфических антител к ВИЧ не означает, что человек болен СПИДом. Каждый положительный результат необходимо подтвердить, исследовав второй образец крови, полученный в другое время. Только после этого результаты тестирования можно сообщить пациенту!»

Каждый раз, направляя пациента на тестирование на ВИЧ, следует выяснять, почему человек решил его пройти. Страх СПИДа — серьезная проблема и представляет собой отнюдь не редкую фобию. Встречаются люди, столь же твердо, сколь и ошибочно убежденные в том, что они ВИЧ-инфицированны, хотя для этого почти всегда нет никаких оснований. Зачастую они обращаются за тестированием раз за разом через короткие промежутки времени, меняют специалистов и порой настаивают на проведении дорогостоящей ПЦР. Нередко они к тому же охвачены бредовой идеей, будто положительный результат тестирования от них скрывают. Такие пациенты нуждаются в психологической, а возможно, и психиатрической помощи, а не в повторном тестировании на ВИЧ.

Источник: www.eurasiahealth.org