Хотя анализы на антитела против ВИЧ являются наиболее удобным способом выявления инфекции, существуют и альтернативные технологии, которые пригодны для точной постановки диагноза, позволяют осуществлять мониторинг ответа на лечение и могут использоваться для эффективного прогноза исхода заболевания. Выделение вируса путем культивирования, анализы на вирусную РНК и анализы на антиген p24 могут использоваться для демонстрации наличия вируса или компонентов вируса в крови, что позволяет верифицировать инфекцию. Эти методы являются высоко специфическими, положительные результаты подтверждают наличие инфекции. Каждый из этих методов, однако, имеет ограничения, и их использование должно быть привязано к соответствующим аналитическим потребностям. Недавно были предложены анализы для определения вирусной нуклеиновой кислоты, однако они требуют сложной технологии и хорошо обученного персонала.
Анализ на антигены ВИЧ используется в настоящее время для скрининга крови в службе переливания крови, а также в некоторых других ситуациях. К достоинствам этого анализа относится простота постановки и экономичность, однако, анализ не является абсолютно совершенным.
Анализ на вирусный антиген p24 позволяет определять белок вирусного капсида (core компонент) в крови, причем этот компонент во время острой фазы инфекции обнаруживается раньше, чем антитела против ВИЧ. Антиген p24 появляется в ранние сроки после заражения в результате исходной вспышки репликации вируса, его появление связано с высоким уровнем виремии во время периода, когда степень контагиозности больного очень высока (1). Когда начинают обнаруживаться антитела против ВИЧ, антиген p24 часто уже не выявляется, вероятнее всего в результате образования комплекса между антигеном и антителами в крови. В случаях его обнаружения антиген p24 является высокоспецифическим индикатором инфекции. Специфичность анализа на антиген p24 при выявлении инфекции ВИЧ с использованием ПЦР в качестве "золотого" (проверочного) стандарта, рассчитанная по данным, полученным с помощью наборов двух фирм-производителей, составляет 99,9%(2). В этом же исследовании чувствительность метода после нейтрализации для подтверждения присутствия антигена p24 (см. ниже) составляла 100%.
Анализ на p24 может быть ценным в следующих ситуациях: (1) выявление ВИЧ инфекции на ранних стадиях; (2) скрининг крови; (3) диагностика инфекции у новорожденного (3) и (4) мониторинг антиретровирусной терапии (4). Основным ограничением этого метода является то, что он не чувствителен при анализе крови, поскольку низкие концентрации антигена трудно выявить и поскольку антигенемия наблюдается лишь транзиторно на различных стадиях инфекции (5). По существу, определение антигена ВИЧ не способно обнаружить инфицированных доноров крови в 75% случаев, если они серонегативны (6).
Антиген p24 обнаруживается в сыворотке или в свободной форме, или в комплексе с анти-p24 антителами. Свободный p24 можно определять с помощью иммуноферментных методов, в то время как определение связанного p24 требует предварительной обработки кислотой для диссоциации комплекса. Процедуры для диссоциации комплексов между антигеном и антителами повышают чувствительность определения p24, но антиген остается не обнаружимым у большинства асимптоматических больных (7). Антитела остаются выявляемыми на протяжении всей инфекции, в то время как антиген p24 в типичных случаях выявляется только на ранних и поздних сроках в ходе инфекции.
После заражения ВИЧ хронологическая последовательность появления в сыворотке маркеров, идентифицирующих инфекцию, является следующей: вирусная РНК, антиген p24 и антитела против ВИЧ. Примерно через 2 недели после заражения виремия, вероятно, увеличивается экспоненциально, а затем уменьшается до стационарного уровня в результате того, что гуморальный и клеточный иммунный ответ ограничивают репликацию ВИЧ. Этот период времени ("серологически латентный период") характеризуется серонегативностью, эпизодически выявляемой антигенемией, виремией (по данным определения РНК) и вариабельными значениями концентрации CD4+ Т-лимфоцитов. Выявление специфических антител против ВИЧ знаменует собой окончание латентного периода и переводит больного в категорию серопозитивных лиц.
Точный момент времени, когда могут быть выявлены ВИЧ РНК, антиген или антитела, зависит от нескольких факторов, включая использованный метод, индивидуальный ответ организма и характеристики вируса. Вирусная РНК может выявляться в пределах первых двух недель с помощью высокочувствительного метода ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы). Антиген, хотя его присутствие имеет транзиторный характер, может появляться уже через 2 недели после заражения и остается в течение 3-5 месяцев (8). Методы определения антител нового поколения, включая методы с использованием сэндвича антигенов, могут выявлять антитела у большинства лиц приблизительно через 3-4 недели после заражения (9). На поздних стадиях инфекции, а именно на этапе прогрессирования к стадии СПИД, содержание анти-p24 антител снижается, и антиген p24 вновь становится выявляемым (10). Снижение содержания антител к p24, образование антигена, а также формирование иммунных комплексов, вероятнее всего, связаны с изменениями характера репликации вируса (11), поскольку антитела к другим компонентам (например, к гликопротеидам оболочки вируса) присутствуют на всем протяжении инфекции (12).
Итак, когда речь идет о скрининге крови или постановке диагноза, серологически латентный период представляет собой период продолжительностью от 3 до 4 недель, когда наличие ВИЧ инфекции невозможно продемонстрировать с помощью анализов на антитела. Методы, выявляющие антиген p24, могут сократить этот период на одну неделю, хотя при этом выявляются не все серонегативные, но инфицированные ВИЧ лица. Анализы, выявляющие вирусную РНК, могут сократить этот латентный период еще на несколько дней, по сравнению с анализом на антитела и антиген, однако такие определения (определения РНК) в настоящее время непригодны для использования в стандартных лабораториях в связи с необходимостью сложного оборудования и высокой квалификации сотрудников. Соответственно, период после заражения, когда постановка диагноза невозможна, может быть сокращен до 2 недель или менее, если использовать всестороннюю стратегию с применением анализов на антитела, антиген p24, а также методы выявления РНК.
В ряде случаев метод определения антигена p24 применяется неправильно. Важно помнить, что анализы на антиген p24 позволяют выявить растворимый антиген p24, являющийся вероятным следствием репликации вируса, но не живой вирус. Поэтому наличие позитивного результата при анализе на антиген не подтверждает, что образец является инфицированным, и метод не должен применяться для этой цели. Единственным способом демонстрации наличия инфекционного вируса в образце является его выделение и культивирование. Отрицательный результат при анализе на антиген не исключает инфекцию, потому что этот анализ недостаточно чувствителен; иными словами, этот тест не следует применять для подтверждения случаев отсутствия инфекции. Выявление антигена говорит об инфекции, и получение положительных результатов у серонегативных лиц может быть эффективным, хотя и не экономичным способом диагностики ранних стадий инфекции.
Анализ на антиген p24 является наиболее ценным для выявления антигена в надосадочных жидкостях культур, которые были засеяны клетками, полученными от больного с подозрением на инфекцию (культивирование и выделение вируса). Определение антигена является предпочтительным методом выявления присутствия свободного антигена в культуре. И этот метод является на два порядка более чувствительным, чем определение обратной транскриптазы (13). Метод является исключительно полезным для выявления вирусного антигена в культуральной жидкости, поскольку во время репликации вируса в надосадочную жидкость выделяются большие количества антигена.
Тест на антиген может выполняться не только на культуральной жидкости и сыворотке, но также и с другими жидкостями. Данные, полученные при испытании спинномозговой жидкости (СМЖ), показывают, что у многих больных с вызванным ВИЧ слабоумием и энцефалопатией СМЖ содержит значительные количества антигена, что вероятнее всего связано с активной репликацией вируса в ткани мозга.
Тест на антиген p24 может быть ценным при скрининге крови, для установления острой инфекции, для мониторинга инфекции, а также в качестве вспомогательного средства диагностики у новорожденных (каждый из этих вопросов обсуждается ниже). Он может использоваться для выявления случаев ранней инфекции после изнасилования, для выявления инфекции после профессиональной экспозиции и как вспомогательный тест в разрешении вопроса о неопределенных результатах, полученных с помощью Вестерн блот анализа. Однако остается неизвестным, в какой степени анализы на антиген p24 могут выявлять антиген из всех кладов вируса, а именно ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИЧ-1 группы О.
В США передача ВИЧ при переливании крови происходит почти исключительно за счет серонегативных доноров во время острой стадии инфекции. В 1995 г. помимо тестирования донорской крови на антитела было введено определение антигена. До этого, по имеющимся оценкам, один случай сдачи крови на каждые 210000-1140000 осуществлялся ВИЧ-инфицированным лицом во время латентного периода, который обычно имеет продолжительность от 22 до 25 дней, но может быть и более длительным (9). Судя по этой оценке риска, в банк крови может ежегодно поступать от 18 до 27 единиц (от 32 до 49 инфекционных компонентов) ВИЧ-инфицированной серонегативной крови (9). По имеющимся оценкам, начав скрининг крови на наличие антигена p24, можно предотвратить от 4 до 6 случаев инфекции ВИЧ, связанной с трансфузиями, что снизит имеющийся риск в расчете на одну единицу крови до 1:562000-1:825000 (9, 14). В США этот риск варьирует в зависимости от географического региона от нуля в регионах с малой заболеваемостью до 1 на 70000 в регионах с высокой заболеваемостью ВИЧ инфекцией (9). К концу 1996 г. сообщалось о четырех случаях передачи ВИЧ-1 от серонегативных по ВИЧ-1 доноров крови.
С целью обеспечения максимальной безопасности запасов крови FDA рекомендовало анализ на антиген p24 для целей скрининга крови, компонентов крови, лейкоцитов, а также плазмы, применяемых для трансфузий (15). Для достижения этой цели, помимо испытания на наличие ВИЧ антител, должен выполняться анализ на антиген p24. Доноры, которые дают положительный результат на антиген p24 (подтвержденный), навсегда исключаются из контингента доноров. Доноры, которые дают неопределенные результаты в отношении антигена p24 (см. ниже), должны быть временно исключены из контингента доноров минимум на 8 недель (15). В последующем взятие крови у этого донора можно возобновить, если результаты анализов на антиген и антитела будут отрицательными. Доноры навсегда исключаются из донорского контингента, если скрининг тест повторно дает положительный результат при любом последующем анализе.
Эти правила в отношении снижения риска инфекций, связанных с трансфузиями, создали определенные сложности, поскольку затраты, связанные с стандартным скринингом доноров крови на антиген p24 могут составлять около 100 миллионов долларов в год, что значительно превосходит стоимость любой другой затраты в области здравоохранения (16).
Многие специалисты согласны с тем, что в большинстве случаев острую инфекцию ВИЧ можно выявить еще до сероконверсии как клинически, так и с помощью лабораторных методов (17). Проведение анализа на антиген p24 может быть полезным для диагностики острой инфекции до сероконверсии у большинства ВИЧ-инфицированных лиц. Быстрая постановка диагноза позволяет проконсультировать больного в ранние сроки и тем самым свести к минимуму передачу заболевания за счет снижения поведения высокого риска и устранения возможной экспозиции, когда уровень виремии является высоким и инфекция находится на высоко заразной стадии. Далее, это позволяет уже на ранних сроках отследить контакты зараженного лица и дает уникальную возможность исследовать физиологические последствия острой инфекции.
Выявление ранних случаев инфекции позволяет в ранние сроки начать терапию (которая имеется в настоящее время), что тем самым потенциально снижает распространение вируса. Многие клинические лаборатории пользуются быстрыми анализами на антитела против ВИЧ для выявления инфекции у больного-источника после экспозиции для того, чтобы начать лечение в максимально ранние сроки после такой экспозиции. У больных высокого риска, которые являются серонегативными, определение антигена p24 может аналогичным образом использоваться для выявления инфекции на ранних стадиях, чтобы можно было начать лечение в сроки, которые представляются клинически разумными.
Служба общественного здравоохранения США не рекомендует применять для диагностики ВИЧ инфекции стандартный анализы на антиген p24 в ситуациях помимо тех, когда речь идет о банках крови и плазмы; это связано с тем, что по имеющимся оценкам среднее время от момента выявления антигена p24 до выявления антител против ВИЧ составляет 6 дней, и не все недавно инфицированные больные имеют обнаружимые уровни антигена p24 (18).
На Международных конгрессах по СПИДу в Вашингтоне в 1987 г. и в Стокгольме в 1988 г. сообщалось, что в ходе прогрессии ВИЧ-инфицированного больного к более серьезной фазе заболевания происходит падение титра антител в сыворотке к белку p24 и увеличение содержания антигена p24 (19). В прошлом, до появления методов определения вирусной нагрузки, определение антигена p24 широко использовалось для мониторинга развития СПИДа и для отслеживания прогрессии заболевания. Хотя в настоящее время многие клиницисты осуществляют мониторинг за ходом инфекционного процесса путем определения вирусной нагрузки, антиген p24 остается источником такого рода информации при значительно меньших затратах и в более короткие сроки. Недавно сообщалось о его использовании с целью выявления тех больных, прогрессия которых к стадии СПИДа может быть быстрой; это было основано на наблюдении о более высокой распространенности p24 антигенемии у таких больных при первом контакте с врачом, когда они оказывались серопозитивными (20). Однако определение антигена p24 используется реже для отслеживания эффективности схем антиретровирусной терапии, теперь для этой цели используется определение содержания ВИЧ РНК.
Выявление инфекции ВИЧ у новорожденного является сложной задачей, так как в организме ребенка на первом году жизни присутствуют материнские антитела против ВИЧ. При анализе у новорожденного неизбежно выявляются антитела матери, поскольку как антитела новорожденного, так и антитела матери имеют аналогичный профиль. Приблизительно через 12 месяцев материнские антитела начинают исчезать из организма ребенка, и появляется возможность ставить диагноз новорожденному на основании определения антител. Новорожденный должен подвергаться мониторингу с использованием анализа на антитела в течение сроков до 18 месяцев, однако даже после исчезновения антител матери может пройти еще несколько месяцев, прежде чем иммунная система ребенка станет достаточно компетентной в плане образования антител. По существу, инфицированный новорожденный, антитела матери в организме которого исчезли к 12 месяцам, может стать серопозитивным к 18 месяцам. В некоторых случаях демонстрация повышения титра антител в ходе времени у новорожденного может служить указанием на истинную инфекцию.
Было показано, что анализы на специфические антитела класса IgM не являются надежными (12). В связи с неопределенностью статуса инфицирования новорожденного при использовании анализа на антитела, ценными для постановки раннего диагноза могут быть методы, основанные на выявлении вирусной нуклеиновой кислоты, антигена p24, а также на выделении вируса (21). Использование методов выделения вируса или выявления вирусной ДНК позволило установить наличие инфекции по истечении первого месяца жизни более чем в 90% случаев (22), к 3 месяцам эта цифра составляет 97% (23). Определение антигена p24 у новорожденных является менее чувствительным методом (50-80%), однако анализы могут достигать упомянутой высокой чувствительности к сроку 6 месяцев. На момент рождения совместное использование антигена p24, культивирования вируса и ПЦР на основе ДНК позволяет предсказать наличие инфекции с вероятностью только 50%, хотя специфичность метода составляет 100% (24). Отрицательный результат ПЦР на протяжении первого месяца жизни подтверждает отсутствие инфекции с вероятностью более 90% (25). Очевидно, что по-прежнему существует необходимость разработки лучших методов для подтверждения случаев ранней инфекции у новорожденного.
Антиген p24 может не выявляться (особенно при асимптоматических инфекциях), поскольку его концентрация в сыворотке может быть низкой вследствие низких темпов репликации вируса. Анализ на антиген является относительно малочувствительным, выявляя его только в концентрациях порядка 10 пг/мл антигена p24. Антиген может не присутствовать в таких количествах в сыворотке ВИЧ-инфицированных лиц, даже когда вирус находится в состоянии активной репликации. По существу, лишь от 50 до 60% больных на стадии СПИДа, от 30 до 40% больных на стадии пред-СПИДа и около 10% асимптоматических больных обнаруживают p24 антигенемию.
Далее, степень антигенемии варьирует в зависимости от тестируемой группы населения. Например, в нескольких исследованиях было показано, что больные африканцы на стадии СПИДа имеют более высокие уровни антигена по сравнению со сходной группой лиц в США (26). И наоборот, больные африканцы, инфицированные ВИЧ, однако не имеющие симптомов, обнаруживают меньшие значения антигена p24 по сравнению с аналогичной группой в США.
Одной из причин недостаточной чувствительности метода определения антигена при проведении анализа в сыворотке ВИЧ-инфицированных лиц является образование комплексов между свободным антигеном p24 в сыворотке и антителами к p24. Анализ не может выявлять антигены, находящиеся в комплексе. Однако даже после диссоциации комплекса чувствительность остается низкой, и анализ может выявлять лишь около 50% асимптоматических больных (7).
Источник: "Определение антигена p24 ВИЧ" Н. Константайн, Медицинская школа Университета Мэриленд
