Методы иммуноферментного анализа (ИФА) наиболее широко используются для скрининга на ВИЧ инфекцию; идея заключается в том, что такие методы основаны на относительно простой методологии, обладают высокой чувствительностью и пригодны для анализа большого числа образцов, особенно в центрах по анализу образцов крови. В настоящее время на рынке существует более сорока различных тест-наборов, основанных на ИФА, однако лишь около десяти из них имеют лицензию FDA для применения в США (1).
Общим свойством всех вариантов ИФА является использование ферментных конъюгатов, связанных со специфическим антителом против ВИЧ, и субстрата/хромогенов, дающих окраску в реакции, катализируемой связанным ферментным конъюгатом. Наиболее широко применяемые методы ИФА основаны на непрямом подходе, в рамках которого ВИЧ антиген присоединяется к стенкам лунки 96-луночнго планшета для микротитрования или к макроскопической сфере, которая затем помещается в лунку на таком планшете. Антитело, присутствующее в образце, реагирует с твердым носителем, покрытым антигеном, обычно в течение 30 минут при 37єC или 40єC. После отмывки несвязанных компонентов сыворотки добавляют конъюгат (иммуноглобулин против иммуноглобулина человека с конъюгированным ферментом) - он связывается со специфическим антителом, которое присоединено к антигену, находящемуся на твердой фазе. После еще одной промывки добавляется соответствующий субстрат, что приводит к развитию окраски, которая выявляется с помощью спектрофотометра и которая пропорциональна концентрации специфического антитела против ВИЧ, находящегося в анализируемом образце. Поскольку окрашенный раствор поглощает проходящий через него свет, регистрируется оптическая плотность, являющаяся количественной мерой степени окраски, которая пропорциональна количеству связанного антитела (т.е. концентрации антитела). Простой математический расчет, обычно основанный на использовании значения оптической плотности отрицательного контроля с умножением на коэффициент, дает величину фона, с которой сравнивается значение оптической плотности образца для определения статуса этого образца в отношении антитела; пробы со значениями более 1,0 (при использовании непрямого ИФА) считаются положительными на наличие антител.
Использование метода с антигеном, нанесенным на сферу, не имеет каких-либо серьезных преимуществ по сравнению с использованием просто планшета для микротитрования; применение того или иного варианта - вопрос предпочтения лаборатории. Оба метода могут быть полностью автоматизированы, причем стоимость также является одинаковой. В нескольких методах непрямого ИФА используются поливалентные конъюгаты (как с анти-IgG, так и анти-IgM) для повышения чувствительности метода с целью выявления ранней стадии ВИЧ инфекции (на этапе сероконверсии).
Другие методы на основе иммуноферментных определений включают конкурентный анализ, при котором специфические антитела против ВИЧ в образце конкурируют со связанным с ферментом антителом за антигенные места посадки на твердой фазе. При использовании этого метода степень развития окраски обратно пропорциональна концентрации специфических анти-ВИЧ антител.
Самым последним добавлением к технологии ИФА является метод, основанный на использовании сэндвича антигена, когда фермент (щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена) конъюгируется с антигеном ВИЧ (аналогично тому, как это делается с иммобилизованным антигеном на твердой фазе). Антитело, находящееся в образце, затем "вставляется в виде сэндвича" между двумя молекулами антигена, одна из которых иммобилизована на твердой фазе, а другая содержит фермент. На следующем этапе добавление субстрата приводит к развитию окраски пропорционально концентрации антитела. Вариант ИФА с использованием сэндвича антигена является наиболее чувствительным методом для скрининга с учетом его способности выявлять все изотипы антител (включая IgM)(2). Одним из недостатков этого метода является необходимость использовать относительно большой объем (150 µл) образца, что может затруднять повторное тестирование или анализ образцов, полученных от маленьких детей.
При острой ВИЧ инфекции в период до появления антител (латентный период или период, предшествующий сероконверсии) инфекцию ВИЧ можно подтвердить только путем демонстрации наличия антигена p24 в кровотоке или демонстрации присутствия вирусной РНК или ДНК. Хотя высокочувствительные методы анализа на антитела позволяют выявлять очень низкие концентрации антител к ВИЧ в крови, латентный период до появления антител лишь в редких случаях можно сократить до сроков менее 3 недель. После появления антител титры неуклонно возрастают на протяжении 3-5 месяцев до максимального значения, на котором они остаются достаточно стабильно на протяжении последующей инфекции. Кроме того, антитела, выявляющиеся на ранних стадиях инфекции, обычно обладают низкой авидностью, однако авидность повышается в ходе прогрессии заболевания. Соответственно, инфекция ВИЧ может быть подразделена на категории недавней инфекции или установившейся инфекции, в зависимости от количества антител, присутствующих в крови, или их силы. Эти параметры могут быть использованы в качестве инструментов для того, чтобы оценить момент времени, когда произошло инфицирование ВИЧ. Например, если титры антител или сила антител являются низкими, вероятно, что инфекция произошла на протяжении последних 4 месяцев; и, наоборот, наличие антител с высоким титром или высокой авидности говорит об уже установившейся инфекции, которая произошла более чем 4 месяца тому назад. В отличие от распространенности ВИЧ инфекции, т.е. общего числа ВИЧ-инфицированных лиц, заболеваемость ВИЧ определяется как изменение распространенности инфекции во времени, т.е. в терминах количества вновь инфицированных больных. Данные по заболеваемости чаще всего рассчитываются путем проведения анализов в группе лиц в различные моменты времени, в результате чего определяется количество случаев новой инфекции. Как легко представить себе, применение этой стратегии затруднительно, поскольку существует необходимость найти тех же самых лиц для повторного анализа. Однако данные по заболеваемости важны не только для определения конкретных групп населения, в отношении которых информационные компании могут быть наиболее полезными или в случаях изменений характера инфицирования; это также важно для выявления соответствующих групп для терапевтического вмешательства или вакцинации.
Были разработаны новые лабораторные стратегии, которые позволяют дифференцировать недавно инфицированных лиц от лиц с уже установившейся инфекцией. Эти подходы основаны на концепциях титра антител или авидности (силы) антител и модификациях процедур обычного ИФА или быстрых методах определения, которые позволяют дискриминировать антитела в отношении титра или силы. Эти модифицированные анализы получили название "загрубленных" анализов или "чувствительных/менее чувствительных" анализов; мы будем пользоваться термином "загрубленный" анализ.
Первая стратегия "загрубленного" анализа основана на том принципе, что тиры антител возрастают в ходе времени, и что можно предполагать наличие недавней инфекции, если результаты анализа перестают быть положительными после разведения соответствующей индивидуальной сыворотки. В таком случае исходно положительный образец при анализе с помощью стандартного метода (чувствительный метод) перестает быть положительным, когда его разбавляют и используют модифицированный метод анализа (менее чувствительный метод). И наоборот, сыворотка лица с уже установившейся ВИЧ инфекцией останется положительной после разведения с использованием менее чувствительного метода анализа из-за высоких концентраций антител. Аналитическая система, которая была модифицирована путем разведения образца, проверена на примере лиц с заведомо известной сероконверсией и сроком инфицирования (система Abbott HIV-1 Viral Lysate ELISA (3A11) и лицензирована FDA (6). Далее мы будем называть ее системой 3А11. Эта стратегия используется только для лиц, ВИЧ-положительный статус которых был подтвержден с использованием критериев Центра по контролю за заболеваниями (CDC) методом Вестерн блота, поскольку лица, дающие отрицательный ответ в тесте на антитела, не могут быть кандидатами на определение момента инфекции. Эта система известна под названием "Алгоритм серологического анализа для определения недавней сероконверсии ВИЧ". Она была разработана и принята на вооружение Центром по контролю за заболеваниями. Конкретные изменения в процедуре анализа 3A11 были введены в отношении трех параметров, для того чтобы снизить чувствительность метода (для менее чувствительного варианта). Для проведения "загрубленного" анализа разведение образца было повышено до 1:20000, время инкубации образца сокращено до 30 минут, время инкубации с конъюгатом сокращено до 30 минут и скорректировано значение оптической плотности фона. Для того чтобы сравнить результаты, которые были получены с помощью "загрубленного" метода, значение оптической плотности (ОП) индивидуальных образцов нормируется с использованием стандартных значений оптической плотности (СОП), основанных на формуле: СОП = (значение ОП образца - значение ОП негативного контроля)/значение ОП положительного контроля. С помощью статистического метода было определено, что значение СОП (фона), равное 0,75, является оптимальным и что отрицательные образцы дают значение СОП меньше фонового. Когда анализируемый образец дал такого рода реакцию при проведении анализа с помощью чувствительного метода и загрубленного метода, то срок после сероконверсии был найден равным 129 дням или почти 4 месяцам (95% доверительный интервал 109-149 дней). Алгоритм использования чувствительного/загрубленного метода анализа был подтвержден в нескольких исследованиях с помощью анализа лиц с заведомо известными случаями раннего инфицирования по данным клинической оценки, недавней сероконверсии, поведения, характеризующегося высоким риском, а также анализов антигена и нуклеиновых кислот. Ограничения такой стратегии могут быть связаны с выявлением лиц с длительной инфекцией (0,4%), а также лиц, находящихся в поздней стадии СПИДа (2%). Для того чтобы подтвердить результаты, полученные с помощью методов сочетания чувствительного/загрубленного анализа, необходимо определять содержания CD4+ Т-лимфоцитов и иметь клиническую информация, для того чтобы обеспечить максимальную точность. Эта стратегия является недорогостоящей и воспроизводимой, может давать достаточно точную оценку времени инфекции. Однако, использование методологии 3A11 в загрубленном варианте занимает много времени и требует повторных определений. В ряде эпидемиологических исследований эта стратегия была использована для предсказания заболеваемости в Сан-Франциско и Рио-де-Жанейро (7, 8, 9). Недавно эта стратегия была подтверждена с использованием ИФА в варианте, разработанном фирмой Organon Technika.
Второй метод определения времени инфицирования для оценки заболеваемости основан на использовании такой характеристики, как авидность антител; он был разработан с применением ИФА третьего поколения. Этот метод получил название Протокол индекса авидности (Avidity Index Protocol). Авидность описывает коллективное взаимодействие между антителами и поливалентным антигеном. Определение авидности используется для того, чтобы получить подтверждающие данные об острой инфекции, для дифференциации реактивации инфекции от первичной инфекции и для подтверждения диагноза острой инфекции на основании анализа одного образца. Индекс дифференциального связывания или авидности (AI) коррелирует с продолжительностью срока, прошедшего после первичной инфекции ВИЧ. Так, сила взаимодействия между присутствующими антителами и антигеном на ранних стадиях инфекции является незначительной, поскольку большинство антител, обнаруживаемых в образцах, полученных от больных на ранних стадиях инфекции, обладает низкой авидностью (ВИЧ-1 антитела). Относительная авидность антител является более высокой при установившейся инфекции, причем она может быть определена серологически на основании устойчивости комплекса антиген-антитело к действию хаотропных агентов. Хаотропные агенты представляют собой диссоциирующие реагенты такие как мочевина (4, 6, и 8 M), тиоцианат калия (1 и 3 M KSCN), хлорид магния (2 и 4 M MgCl2), диэтиламин (0,025, 0,05 и 0,1 M DEA) и гуанидин гидрохлорид (3 и 6M).
Наиболее известным анализом на индекс авидности является анализ, использующий рекомбинантный вирусный лизат (rLAV) в варианте ИФА фирмы BioRad (Genetic Systems) (10) с модификацией, заключающейся в введении этапа диссоциации и промывки. Наиболее эффективным хаотропным агентом, вызывающим диссоцииацию молекул ВИЧ антител с низкой авидностью из комплекса, был 2,5 M KSCN. Для выполнения процедуры лунки с разбавленным образцом в двукратной повторности инкубируют с антигеном ВИЧ. Антитела против ВИЧ связываются с антигеном и после промывки в одну из лунок (положительная проба) добавляют раствор диссоциирующего реактива, в то время как в другую лунку добавляют промывающий раствор (Контроль). Результаты интерпретируют на основании расчета индекса авидности (ИА) по процентному соотношению оптической плотности в пробе, обработанной KSCN по отношению к контролю, который не подвергся такой обработке. В тех случаях, когда значение ИА составляет менее 80%, результаты интерпретируют как указание на раннюю инфекцию, т.е. 3-4 месяца (120 дней) от момента сероконверсии. Этот метод был подтвержден с использованием образцов, полученных от лиц из выборок с сероконверсией, а также на основании образцов, полученных от больных с клинически подтвержденной инфекцией ВИЧ.
Недавно наша лаборатория разработала быстрый метод, основанный на использовании чувствительного/загрубленного метода, на основании теста UniGold HIV (Trinity Biotech) - это 10-минутный быстрый анализ с визуальной регистрацией. Этот метод, основанный на разведении сыворотки для менее чувствительного определения, продемонстрировал отличные результаты по сравнению с методом Abbott 3A11 при оценке с использованием образцов от лиц с известными датами сероконверсии. Кроме того, мы получили предварительные результаты с использованием анализа на ВИЧ антитела в слюне SalivaCard (Trinity Biotech), который также оказался полезным в качестве чувствительного/загрубленного метода (11). Преимущества быстрых анализов такого рода заключаются в том, что они являются портативными и могут использоваться для выявления групп с высокой заболеваемостью в отдаленных районах, куда приборы, необходимые для ИФА, не могут быть доставлены. Кроме того, даже в развитых странах они могут быть легко адаптированы для использования в передвижных лабораториях с целью выявления недавно инфицированных лиц; таким образом, инфицированные могут быть своевременно проконсультированы для выявления лиц, имевших с ними контакт на протяжении предшествовавших нескольких месяцев или выявленные лица сразу направляются в соответствующие центры для лечения. Наконец, наличие быстрых методов с использованием слюны в качестве образца может улучшить охват тестированием, поскольку методы сбора материала являются неинвазивными.
Стратегия выявления ВИЧ-инфицированных лиц на ранних стадиях инфекции дает целый ряд преимуществ. Выявление инфекции в пределах предшествовавших 4 месяцев может позволить легче отслеживать контакты, связанные с внутривенным введением наркотиков или сексуальные контакты, и это может позволить определить, когда и кем была передана инфекция, поскольку человеку легче запомнить контакты на протяжении последних 4 месяцев, чем контакты, которые имели место год назад или ранее. Выявление и последующее вмешательство в группах с высокой заболеваемостью будут способствовать снижению передачи заболевания, поскольку высокие значения вирусной нагрузки, которые развиваются на ранних стадиях инфекции, способствуют повышенной передаче вируса. Мониторинг зон с высокой заболеваемостью ВИЧ имеет также важные клинические и терапевтические последствия для диагноза у новорожденных и для раннего начала антиретровирусной терапии; это также может дать информацию для целей прогнозирования, выявления людей, которые получат максимальные преимущества от вакцинации, и будет способствовать вовлечению недавно инфицированных лиц в исследования по патофизиологии или фармакотерапии.
У большинства больных антитела могут быть выявлены в пределах от 6 до 12 недель после инфекции с использованием методов анализа предшествующих поколений, однако с использованием более новых методов третьего поколения, основанных на применении сэндвича антигенов, они могут выявляться в сроки от 3 до 4 недель после заражения (12). Латентный период может быть уменьшен приблизительно до 2 недель при использовании анализа на антиген р24 или даже до 1 недели при применения анализа на вирусную нуклеиновую кислоту (13). Соответственно, латентный период между самим моментом инфекции и моментом выявления инфекции может составлять менее 2 недель, если использовать всесторонний подход к анализам. Выявление антигена р24 с помощью ИФА представляет собой простой и экономный способ для демонстрации наличия вирусного капсидного (core) белкар24 в крови больного во время острой фазы инфекции за счет исходного взрыва репликации вируса после инфицирования. Для того чтобы максимизировать выявление всех ВИЧ-инфицированных лиц, особенно на ранних стадиях инфекции, необходимо применять анализы для выявления антител, антигена и вирусной РНК. Однако анализы для выявления вирусной РНК являются дорогостоящими, требуют времени и многие лаборатории не могут их выполнять. Лаборатории, располагающие возможностями для проведения ИФА, могут повысить способность выявлять большинство случаев инфекции, выполняя анализы как на антитела против ВИЧ, так и на антиген р24. В конце 1990 г.г. были разработаны анализы в рамках методологии ИФА, которые позволили выявлять как антитела против ВИЧ, так и антиген р24 ВИЧ одновременно, что снимало необходимость выполнения отдельных анализов.
Новое поколение комбинированных ИФА, одновременно выявляющих как антиген, так и антитела, было разработано и уже выпущено на рынок; его преимуществами является сокращение времени, необходимого для анализа, снижение трудозатрат и большая экономичность, по сравнению с тем, когда каждый из анализов выполнялся индивидуально. Эти методы продемонстрировали высокую аналитическую чувствительность выявления, которая вероятнее всего связана с использованием комбинации метода третьего поколения (сэндвич антигенов) для выявления антител и потенциала для одновременного выявления р24 антигена ВИЧ. В настоящее время в США имеется восемь коммерческих комбинированных методов для определения антител и антигена, которые описаны и подвергнуты оценке (14, 32). Эти методы четвертого поколения включают следующие анализы: VIDAS HIV DUO Ultra (bioMerieux), Enzymun-Test-HIV-Combi (Boehringer Mannheim), VironostikaHIV Uni-Form II Ag/AB (Organon Teknika), AxSYM-HIV Ag/AB (Abbott), Enzygnost HIV Intergral (Dade Behring Marburg), Genescreen Plus HIV Ag-AB (BioRad) и COBAS Core HIV Combi (Roche Diagnostics GmbH). Восьмой метод представляет собой 18-минутный комбинированный анализ на основании использования сэндвича двух антигенов под названием Elecsys-HIV Combi (Boehringer Mannheim) (17); по имеющимся сообщениям, этот метод дает специфичность 99,8% при испытании на группе госпитализированных больных.
Этот быстрый метод основан на применении электрохемилюминесценции и, по имеющимся сообщениям, сокращает латентный период на 5 дней, по сравнению с анализами, основанными на применении антител. Девятый, не описанный детально метод представляет собой линейный иммуноферментный метод, чувствительность которого составляет 99.5%, а специфичность только 94.8%.
Преимущества проведения анализа, как на антитела, так и на антиген, оправдываются необходимостью выявлять лиц с уже установившейся инфекцией и ранними стадиями ВИЧ инфекции не только среди доноров крови, но и в связи с определенными клиническими ситуациями. Раннее выявление инфекции за счет анализа на антиген способствует быстрому направлению ВИЧ-инфицированных лиц на терапию, консультирование и меры, связанные с профилактикой, с тем, чтобы уменьшить риск передачи инфекции. ИФА четвертого поколения благодаря способности выявлять антиген р24 представляют ценность для выявления инфекции на ранних стадиях. Эти методы очень полезны для диагноза ранних стадий и уже установившихся этапов ВИЧ инфекции в больницах и частных клинических лабораториях и в других лабораторных условиях. При этом проверяемые на инфекцию лица относятся к группам более высокого риска, по сравнению с группой доноров крови, и это обстоятельство требует применения методов анализа с высокой аналитической чувствительностью для выявления случаев первичной инфекции. Важно отметить, что высокий уровень аналитической и эпидемиологической чувствительности, продемонстрированный большинством методов четвертого поколения на лицах с сероконверсией и кладов, а также у различных групп больных, делает их идеальными для применения в целом ряде ситуаций для диагностики как ранней, так и уже установившейся инфекции. В стандартных лабораторных условиях образцы, содержащие ВИЧ, могут быть идентифицированы за счет определения антигена, в то время как это было бы невозможно при использовании обычного скрининга на антитела, поскольку тестирование на антиген не выполняется в качестве стандартной процедуры скрининга вне рамок тестирования доноров. Выявление ранних случаев инфекции, как было показано, является ценным для незамедлительного начала соответствующей антиретровирусной терапии в клинически важном временном контексте. Кроме того, раннее выявление может способствовать своевременному началу мероприятий, таких как консультирование больных, предотвращение передачи инфекции и ведение больного.
Быстрые анализы для определения специфических антител против ВИЧ были разработаны в конце 1980-х годов, это анализы, которые можно выполнить менее, чем за 30 минут. Популярность этих анализов возросла в начале 1990-х, поскольку технология стала более совершенной, и зарекомендовала себя такой же точной, как технология ИФА при тщательном выполнении опытным персоналом. Однако при проведении таких анализов часто возникают технические ошибки, поскольку лабораторные работники становятся невнимательными при проведении этих простых процедур. Например, пипетки не всегда держат строго вертикально, что приводит к неправильному отмериванию объемов реактивов. Помимо этого, многие лаборанты пытаются одновременно проводить анализ многих образцов, что приводит к неточности соблюдения сроков инкубации для разных этапов.
При правильном исполнении быстрые анализы на антитела против ВИЧ являются точными и имеют широкое применение в целом ряде ситуаций. Области их применения включают пункты неотложной помощи, кабинеты врача, проведение анализов непосредственно в пунктах приема больных, анализы при аутопсиях, анализы в похоронных домах, небольших банках крови и для оперативного тестирования на ВИЧ (если требуется немедленное начало лечение в случае экспозиции). Быстрые анализы на ВИЧ оказались особенно ценными для тестирования беременных женщин в предродовом периоде, у которых не проводилось дородовое лечение (иными словами, их ВИЧ статус является неизвестным). Было показано, что начало антиретровирусной терапии (в частности, применение зидовудина) является эффективным способом снижения передачи ВИЧ, и что такого рода лечение должно проводиться матери в максимально ранние сроки, а затем проводиться новорожденному. Быстрое тестирование на ВИЧ матери непосредственно в дородовом периоде позволяет начать лечение до родов в случае выявления положительного статуса (33). Важно отметить, что быстрые анализы легко выполняются и представляют особую ценность для использования в развивающихся странах, где имеющееся оборудование может быть не оптимальным, отсутствует стабильная подача электроэнергии и отсутствуют программы формального обучения лаборанта.
Одним из класса быстрых анализов является "дот-блот" или "иммуноблот"; в результате выполнения этих анализов образуется четко видимая окрашенная точка на твердой поверхности, если анализ дает положительный результат. Большинство этих быстрых анализов в настоящее время содержит внутренний контроль, который показывает, что анализ был выполнен корректно. Этим контролем является иммуноглобулин против иммуноглобулина человека, который связывает любой иммуноглобулин, присутствующий в образце, и это дает отдельный индикатор, если все реактивы были добавлены надлежащим образом. Отметим, что некоторые варианты этого анализа содержат две точки "двойной дот-блот", что позволяет дифференцировать инфекцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2.
Процедуры, используемые для дот-блот анализов, являются сходными, независимо от конкретной реализации этого метода. В большинстве методов требуется покапельное добавление реактивов в следующей последовательности: буфер, образец, промывной буфер, конъюгат, промывной буфер, субстрат и стоп-раствор. В некоторых анализах используется краситель, связывающийся с IgG (реактив, представляющий собой конъюгат белка А с золотом) вместо антииммуноглобулинового конъюгата, в результате последовательность операций уменьшается на один этап.
Другие варианты быстрых анализов включают погружные "карандаши", когда антиген присоединяется к "зубьям" устройств типа гребенки; некоторые из таких быстрых аналогов дают возможность дифференциального выявления ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Недостатки этих методов включают субъективность интерпретации, трудность считывания результата, если лаборант дальтоник, и более высокая стоимость по сравнению со стоимостью метода ИФА. Один из быстрых анализов на ВИЧ утвержден для использования в США.
Такие типы анализов на ВИЧ требуют более 30 минут, однако в них применяются процедуры, которые легко выполняются в отсутствие приборного обеспечения. К этому классу анализов относится анализ на основе агглютинации, когда частицы, покрытые антигеном (эритроциты, частицы латекса или частицы желатины) реагируют с антителами сыворотки, образуя видимую агглютинацию(образование комочков). При использовании эритроцитов методику называют пассивной гемагглютинацией (ПГА); при использовании частиц латекса методику называют методом агглютинации латекса (АЛ). В странах Дальнего Востока получила широкое распространение методика, основанная на агглютинации желатиновых частиц; она имеет хорошую чувствительность, обладает низкой стоимостью и легка для выполнения. Ее составной частью является система контроля качества для выявления неспецифических антител, к частицам желатины, причем результаты могут быть получены в пределах 2 часов с минимальными затратами труда. Хотя этот анализ является подходящим для учреждений с ограниченными возможностями, следует отметить, что он должен выполняться в условиях контроля температуры.
"Тест-системы на ВИЧ-специфические антитела" Н. Константайн, Медицинская школа Университета Мэрилэнд
