» Молекулярная гибридизация и ПЦР

Молекулярная гибридизация и ПЦР

Молекулярная гибридизация и ПЦР

Методы ИФА, ИБ, несмотря на очевидную простоту, чувствительность, доступность, имеют существенные недостатки, связанные с наличием перекрестных реакций белков нормальных сывороток с антигенами ВИЧ, что приводит к ложнопозитивным результатам. Такие случаи требуют дифференциальной диагностики и прямого выявления нуклеиновых кислот в исследуемом материале с помощью реакции молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Диагностическая суть этих методов заключается в том, что у исследователей имеются определенные олигонуклеотилы, воспроизводящие (или комплементарные), высококонсервативные и высокоспецифичные последовательности нуклеотидовиз искомого генома. В реакции молекулярной гибридизации такие олигонуклеотилы называют зондами, в методе ПЦР -праймерами. В реакции молекулярной гибридизации назначение этих специфических олигонуклеотидов-"найти'' в исследуемой нуклеиновой кислоте комплементарные последовательности, и сформировать структуры согласно природе комплементарных взаимодействий между парами азотистых оснований (Бобков А.Ф. и соавт., 1999, Бобкова М., 2000).

При ПЦР используют фермент Tag-полимераза, выделенный из термофильных бактерий Thermus agualieus, проявляющий активность при температуре 72°С.

Каждый цикл ПЦР состоит из трех этапов: а) денатурация исследуемой нуклеиновой кислоты б) отжиг, во время которого праймеры связываются с участками ДНК; в) комплементарное достраивание последовательности ДНК. После каждого цикла количество ДНК удваивается, в течение двух часов осуществляется 20-30 раз, при этом количество амплифицированной ДНК увеличивается в тысячи раз (1).

Материалом для исследований служит кровь, культуральная жидкость, ликвор, биопсийный материал, носоглоточные смывы, моча и пр. биологические субстанции. Молекулярно-генетические методы перспективны при необходимости ранней диагностики ВИЧ до появления в сыворотке AT, при неясных серологических результатах, при определении наличия ВИЧ в организме новорожденных детей от инфицированных женщин. Целесообразно использовать эти методы при обследовании серонегативных сексуальных партнеров инфицированных лиц (18).

В настоящее время имеется множество модификаций ПЦР, но необходимо учитывать, что для постановки реакции требуется не только специальное оборудование, но и набор отдельных помещений с соблюдением особого режима, нарушение которого приводит к ложнопозитивным результатам вследствие контаминации реакции ампликонами.

Источник: АХ. Рахманова, Е.Н. Виноградова, Е.Е. Воронин, А. А. Яковлев "ВИЧ-инфекция"

Напишите нам