Методика анализа на антиген p24

Методика анализа на антиген p24

Принцип анализа

Хотя в наборах разных фирм используются разные процедуры, анализы на антиген p24 основаны на технологии иммуноферментного анализа (ELISA) с модификациями для выявления антигена, а не антител. В типичном анализе, таком как анализ с использованием "сэндвича с антителами", специфическое моноклональное антитело к p24 ВИЧ прикрепляется к твердой фазе (планшет для микротитрования или полистироловая сфера), которые иммобилизуют ("захватывают") вирусный антиген, присутствующий в образце. Образец разбавляют раствором, содержащим детергент Тритон X100 для разрушения вирусных частиц, и если антиген присутствует в сыворотке, он присоединяется к моноклональным антителам, находящимся на твердой фазе. После этапа промывки добавляют детектирующее антитело и проводят инкубацию. Детектирующий реактив обычно представляет собой антитело высокого титра к антигену p24, связанное с биотином. Далее, проводится инкубация с конъюгатом (стрептавидин-пероксидаза), в результате чего комплекс оказывается помеченным за счет присоединения стрептавидина к биотину. Система авидин-биотин действует в качестве усилителя для генерирования дополнительного сигнала с целью выявить небольшие количества антигена, присутствующего в образце. Добавление субстрата (тетраметилбензидин) приводит к развитию окраски, в результате того, что фермент расщепляет субстрат. Наконец, добавляется слабый раствор кислоты (например, 2 M серная кислота), в результате чего реакция останавливается после определенного периода времени. Конечная оптическая плотность пропорциональна количеству антигена p24 в образце. Такой анализ может определять антиген p24 в интервале концентраций от пикограмм до наннограмм в миллилитре. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре при длине волны 450 нм.

Подтверждение присутствия антигена p24

Анализы на антиген p24 могут искажаться ложно-положительными реакциями, вероятно, обусловленными наличием мешающих веществ и иммунных комплексов. Поэтому образцы, которые дают положительную реакцию на антиген, должны быть подвергнуты подтверждающему анализу с использованием более специфического метода. Для проверки специфичности используется анализ с нейтрализацией антигена. Такой набор для выполнения нейтрализации применяется в качестве дополнительного реактива для анализа на антиген p24. Добавка включает нейтрализующий реактив, используемый на этапе предобработки перед повторением определения антигена p24.

Образец, предположительно содержащий антиген, инкубируется с нейтрализующим реактивом, представляющим собой антитело к антигену p24 человека. Во время инкубации, если антиген присутствует, он будет комплексироваться с нейтрализующим антителом и не даст возможности антигену p24 связаться с иммобилизующим реактивом, находящимся на твердой фазе, в основном анализе на антиген p24. Далее, определение антигена повторяют на таком преинкубированном образце параллельно с аликвотой того же самого образца, которая не была преинкубирована с нейтрализующим реактивом, и сравниваются значения оптической плотности. Для подтверждения присутствия антигена в пробе значения оптической плотности образца после нейтрализации должны быть снижены, по крайней мере, на 50% по сравнению с оптической плотностью аликвоты, не подвергнутой нейтрализации. Если такого рода снижения (подавления) не происходит, образец считается неподтвержденным в отношении наличия антигена, и его реагирование, вероятно, не обусловлено наличием антигена p24; этот вопроса может быть решен с помощью определения РНК или повторного анализа.

Поскольку все определения выполняются в двух или четырех повторностях, для полного анализа с подтвержденным результатом требуется почти 1 мл сыворотки. Анализ также является относительно дорогостоящим, по крайней мере, вдвое дороже, чем анализы на антитела. Кроме того, в зависимости от числа требуемых повторностей и общего количества анализируемых образцов, затраты могут оказаться очень высокими. Описан протокол определения антигена p24, который специально предназначен для анализа большого числа образцов, причем он является более экономичным по сравнению с наборами, выпускаемыми коммерчески (27).

Количественное определение p24

Для определения концентрации антигена p24 в крови готовится ряд разведений стандартного антигена ВИЧ-1 (шесть стандартов различной концентрации). Концентрации варьируют от 0,0 до125 пг/мл. Строят стандартную кривую, на основании которой определяют концентрацию для неизвестных образцов по данным оптической плотности. Стандартная кривая строится с использованием линейного графика, так что концентрация антигена p24 ВИЧ (стандарт в пг/мл) на оси абсцисс откладывается по отношению к среднему значению оптической плотности для каждого стандарта на оси ординат. Каждый стандарт измеряется в двух повторностях, используется не менее пяти контролей (три негативных контроля и два положительных). Если значение для неизвестного образца является более высоким, чем значение для максимального стандарта, образец следует разбавить нормальной сывороткой человека и повторить всю процедуру нейтрализации.

Повышение чувствительности определения (диссоциация иммунного комплекса)

Для повышения чувствительности анализа на антиген p24 фирмы-производители предложили проводить процедуру диссоциации иммунного комплекса (ДИК) при низких значениях pH перед выполнением анализа на антиген. При использовании этой процедуры было показано повышение чувствительности метода, особенно для лиц с асимптоматической ВИЧ инфекцией. Процедура диссоциации позволяет выявлять как свободный антиген p24, так и антиген p24, находящийся в комплексе с антителами. Этот метод не только повышает число антиген-позитивных лиц (эпидемиологическая чувствительность), но также позволяет выявлять более низкие количества антигена p24 (повышение аналитической чувствительности) (28). Хотя ДИК может приводить к повышению чувствительности анализа на антиген, выявление ВИЧ-инфицированных лиц продолжает оставаться на уровне, составляющем только около 50%.

В самое последнее время было опубликовано сообщение, показывающее, что определение антигена p24 может быть модифицировано с целью повышения чувствительности для выявления инфекции ВИЧ на ранних стадиях; при этом чувствительность приближается к чувствительности метода ПЦР (определение вирусной нагрузки), и такой анализ на антиген может быть более эффективен для мониторинга заболевания и предсказания результата (29). В сообщении описывается модификация (добавление вещества из группы тирамидов) диссоциации иммунного комплекса, содержащего антиген p24, когда на последнем этапе используется амплификация сигнала, в результате чего может определяться меньшее количество антигена p24. Поскольку определение антигена p24 само по себе никогда не было особенно чувствительным (за исключением анализа культуральных жидкостей), такого рода модификация может оказаться очень полезной. Преимуществами по отношению к ПЦР является простота, экономичность и высокая производительность. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить функциональные результаты и ценность этого метода.

Интерпретация результатов

После исходного анализа на антиген p24 результаты относят к положительным или отрицательным в зависимости от вычисленного фонового значения. В случае получения положительного результата анализ повторяют в двух повторностях на том же самом образце. Если исходный результат является отрицательным или если исходный результат является положительным, но обе повторности при повторном анализе дают отрицательный результат, то образец считается отрицательным. Если, по крайней мере, два результата (непосредственно следующие друг за другом) являются положительными, образец считается предположительно содержащим антиген p24, и данные должны быть подтверждены с использованием метода нейтрализации.

После проведения анализа с помощью метода нейтрализации антигена p24 на образцах, которые повторно дают положительные результаты, результаты могут считаться истинно положительными или неопределенными (Отсутствие нейтрализации или несоответствие другим критериям приемлемости). Повторно положительные результаты испытания на антиген p24, не дающие положительного результата в тесте нейтрализации, вероятно, не связаны с ВИЧ инфекцией. Если сыворотки отвечают критериям положительности за счет применения нейтрализации, это свидетельствует об истинной инфицированности ВИЧ.

Для подтверждения теста нейтрализации должны быть удовлетворены следующие критерии: (1) значение оптической плотности образца, к которому был добавлен негативный (не нейтрализующий) реактив, должно быть выше, чем сумма среднего значения, получаемая на нормальной сыворотке человека, плюс некая константа; (2) оптическая плотность аликвоты, к которой был добавлен нейтрализующий реагент, должна снижаться, по крайней мере, на 50% и (3) каждый контроль должен давать значение оптической плотности в пределах интервала, установленного фирмой-изготовителем. Анализируемые материалы включают лунки для определения фоновых значений, поскольку при этом получаются значения, обусловленные неспецифическими взаимодействиями. Нейтрализуемость образца, содержащего нейтрализующий реагент, рассчитывается по следующей формуле:

Нейтрализуемость =[(S2 - BC) - (S1 - BC)]X100/(S2 - BC)

где:
S2 = образец плюс "отрицательный реагент"
S1 = образец плюс нейтрализующий реагент
BC = значение фона

Для подтверждения того, что количественное определение антигена p24 выполнено надлежащим образом, необходимо удостовериться, что оптическая плотность стандарта удовлетворяет определенным критериям. Эти критерии варьируют в зависимости от фирмы-изготовителя, однако обычное требование, чтобы средняя оптическая плотность стандарта с концентрацией 0 пг/мл и контроля на субстрат была менее 0,100, а средняя оптическая плотность стандарта с концентрацией 62,5 пг/мл была равна 0,500 или более.

Ограничения метода количественного определения антигена p24

Большинство ВИЧ-инфицированных лиц продуцируют антитела к p24, концентрации которых варьируют от одного взятия крови к другому, что влияет на возможности выявления и количественной оценки антигена p24. Даже после диссоциации иммунных комплексов антитела хозяина могут рекомбинировать с антигеном p24, влияя на определение p24 за счет конкуренции с реагентом, используемым для иммобилизации (моноклональное антитело, иммобилизованное на твердой фазе). Скорость рекомбинации зависит от концентрации антигена p24 и антител к p24, сродства антител, времени и температуры реакции.

В связи с возможностью быстрой деградации антигена p24 ВИЧ в образцах, хранящихся в неподходящих условиях, лица, у которых результаты нейтрализации являются неопределенными, должны быть подвергнуты повторному анализу с использованием нового образца. Наиболее частыми причинами неопределенных результатов теста нейтрализации (когда критерии не удовлетворяются) являются следующие: неспецифическая реакция у неинфицированного лица, низкие концентрации антигена p24 у инфицированного лица или деградация образца или образование комплекса антиген-антитело при хранении (18).

Оценка квалификации лаборатории в отношении анализа на антиген p24

Офис программ практического здравоохранения Отдела лабораторных систем Центра по контролю за заболеваниями (CDC) внедряет программу оценки функционирования лаборатории в плане анализа на антиген p24 (30). Лаборатории дважды в год получают набор сывороток и сообщают о результатах в Центр по контролю за заболеваниями (CDC). CDC после этого составляет и распространяет среди участвующих лабораторий отчеты, которые описывают адекватность их методов анализа. Программа является добровольной и бесплатной. (Телефон в США 770-488-4366).

Внешние стандарты контроля качества

Целесообразно включать внешний стандарт при выполнении определения антигена p24. Такой контроль, в отличие от внутренних контролей, содержащихся в наборе для определения, дает возможность проверить всю процедуру (включая способность внутренних контролей давать соответствующие фоновые значения). Кроме того, есть возможность анализа вариаций между определениями, в пределах данного определения и для разных партий наборов реактивов. Детальное описание использования внешних контролей для этой цели было опубликовано в литературе (12). Выпускается несколько стандартов для анализа на антиген p24 (31).

Источник: "Определение антигена p24 ВИЧ" Н. Константайн, Медицинская школа Университета Мэриленд

Напишите нам