» Количественное определение РНК ВИЧ в плазме (вирусная нагрузка)

Количественное определение РНК ВИЧ в плазме (вирусная нагрузка)

Количественное определение РНК ВИЧ в плазме (вирусная нагрузка)

Методы

  • ПЦР на РНК ВИЧ (Amplicor HIV-1 Monitor Test 1.5, фирма-изготовитель Roche; 800-526-1247)
  • Метод разветвленной ДНК (Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay, фирма- изготовитель Bayer; 800-434-2447)
  • Изотермальная реакция амплификации последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA) (NucliSens HIV-1 QT, фирма- изготовитель bioMerieux, 800-682-2666)
Воспроизводимость результатов.

Как показано в таблице 2.4, у каждой тест-системы свой порог и диапазон чувствительности (J Clin Microbiol 1996; 34:3016; J Med Virol 1996; 50:293; J Clin Microbiol 1996; 34:1058; J Clin Microbiol 1998; 36:3392). Два стандартных отклонения (95% доверительный интервал) для результатов тестов составляют 0,3–0,5 log10 (т. е. результаты могут отличаться в 2–3 раза) (J Infect Dis 1997; 175:247; AIDS 1999; 13:2269). Это значит, что 95% доверительный интервал для значения 10 000 копий/мл составляет от 3 100 до 32 000 копий/мл. Значения вирусной нагрузки, полученные при использовании тест-системы Amplicor 1.5 (Roche) и методом рДНК (Versant 3.0), близки, за исключением нижнего участка линейного диапазона (

Подтипы ВИЧ.

При определении вирусной нагрузки не-В-подтипов ВИЧ наблюдается значительно больший разброс показателей. Метод разветвленной ДНК (Versant 3.0) несколько превосходил остальные методики в отношении определения вирусной нагрузки ВИЧ подтипов A–D, F, G, CRF01_AE и CRF01_AG (межподтиповых рекомбинантных форм) и O; при использовании этого метода 83% результатов различались не более чем на 0,5 log10. При использовании Amplicor Monitor 1.5 этот показатель был 74%, а для NucliSens — 61% (J Clin Microbiol 2005; 43:3860). Результаты других исследований подтверждают эти данные (J Med Virol 2006; 78:883; J Acquir Immune Defic Syndr 2002; 29:330).

Таблица 2.4. Тесты на ВИЧ-1

Метод Чувст. Дополнительные сведения
Стандартный протокол серологического тестирования 99,7% Доступное и недорогое. Чувствительность >99,7%, специфичность >99,9% (MMWR 1990; 38:380; N Engl J Med 1988; 319:961; JAMA 1991; 266:2861).
Экспресс-тест
См. стр. 12–13 и таблицу 2.2
99,6% Результат готов через 20 минут. Преимущества «простых» тестов по классификации CLIA (Ora-Quick и Uni-Gold Recombigen) состоят в том, что для тестирования не требуется лабораторного оборудования, получение результата занимает не более 20 минут и для интерпретации результата не требуется специальной подготовки. Отрицательный результат тестирования не требует подтверждения; положительный результат следует подтвердить методом вестерн блота. В таблице 2.2 перечислены экспресс-тесты, одобренные FDA для применения в США (www.cdc.gov/hiv/rapid-testing). Существуют и другие экспресс-тесты, но они не лицензированы FDA (Int J STD AIDS 2006; 17:357; Vox Sang 1997; 72:11; J Clin Microbiol 2004; 42:3850).
Анализ слюны
(тест-система OraSure)
99,6% Приспособление для сбора IgG из слюны для исследования при помощи ИФА и вестерн блота. Преимущество: нет необходимости в венепункции. Чувствительность и специфичность сопоставимы с чувствительностью и специфичностью стандартного протокола серологического тестирования (JAMA 1997; 227:254).
Анализ мочи
(Calypte HIV-1 Test)
>99% Исследуется только методом ИФА, поэтому положительные резуль- таты должны подтверждаться при помощи стандартного протокола серологического тестирования. Проводится врачом. Стоимость невелика — около 4 долларов за тест.
Выделение вируса в культуре МКПК 95–100% МКПК пациента в течение 28 дней инкубируют со стимулирован- ными фитогемагглютинином донорскими МКПК в присутствии ИЛ-2. Метод дорогой и трудоемкий. Может быть качественным и количественным. Основное применение качественного метода — выделение вируса для дальнейшего изучения (например, секвенирования). Исследования, предшествовавшие появлению количественной ПЦР на РНК ВИЧ, показали, что результаты количественного анализа культуры коррелируют со стадией заболевания: средний титр ВИЧ у пациентов со СПИДом составлял 2000/106 клеток (N Engl J Med 1989; 321:1621).
ПЦР на провирусную ДНК >99% Качественная ПЦР на ДНК ВИЧ используется для обнаружения интегрированной в клетку провирусной ДНК, в том числе в периферических лимфоцитах CD4 (резервуарах ВИЧ) при обследовании пациентов, отвечающих на ВААРТ. Порог чувствительности метода составляет около 5 копий на 106 клеток (J Virol Methods 2005; 124:157). Считается недостаточно точным для установления окончательного диагноза ВИЧ-инфекции; его результаты требуют подтверждения. Метод не утвержден FDA (Ann Intern Med 1996; 124:803), хотя в отдельных случаях его используют при спорных или неопределенных результатах серологических тестов.
ПЦР на РНК ВИЧ 95–98% Ложноположительные результаты в 2–9% случаев, обычно показывают низкую вирусную нагрузку (10 000 копий/мл приближается к 100%.
Антиген р24 30–90% Благодаря небольшой стоимости иногда используется в качестве альтернативы тесту на РНК ВИЧ для диагностики острой ВИЧ- инфекции. Специфичность 100%, но чувствительность около 90% — меньше, чем у количественных тестов на РНК ВИЧ (Ann Intern Med 2001; 134:25). Он также применяется в качестве экономичного способа определения вирусной нагрузки в условиях ограниченных ресурсов (J Clin Micro 2005; 43:506).
Половые различия.

Метаанализ 12 публикаций выявил наличие умеренных различий уровня вирусной нагрузки у мужчин и женщин: оказалось, что вирусная нагрузка у женщин в среднем на 0,23 log10 /мл (? в 2 раза) ниже, чем у мужчин (J Acquir Immune Defic Syndr 2002; 31:11). Однако эти различия исчезают при количестве лимфоцитов CD4 -1 и поэтому практически не влияют на решения относительно лечения (J Acquir Immune Defic Syndr 2000; 24:218; J Infect Dis 1999; 180:666; Clin Infect Dis 2002; 35:313; Lancet 1998; 352:1510; N Engl J Med 2001; 344:720).

Показания.

Количественный метод определения РНК ВИЧ используется для диагностики острой ВИЧ-инфекции, прогноза вероятности передачи вируса, прогноза темпа прогрессирования ВИЧ-инфекции, выявления показаний к началу антиретровирусной терапии, а также для наблюдения за эффективностью лечения (Ann Intern Med 1995; 122:573; N Engl J Med 1996; 334:426; J Infect Dis 1997; 175:247; J Infect Dis 2002; 185:905).

  • Острая ВИЧ-инфекция. Уровень РНК ВИЧ в плазме обычно определяют с целью диагностики острого ретровирусного синдрома до завершения сероконверсии (N Engl J Med 2005; 352:1873). В большинстве случаев определяется высокая концентрация вируса (105–106 копий/мл). Отметим, что у 2–9% людей, не инфицированных ВИЧ, исследование дает ложноположительные результаты, практически всегда показывая низкую концентрацию РНК ВИЧ (
    В штате Северная Каролина применялся следующий протокол выявления больных острой ВИЧ-инфекцией: из образцов крови с отрицательными или неопределенными результатами стандартного серологического тестирования брали по 200 мкл и формировали «малые» смеси из каждых 10 образцов. Затем брали по 200 мкл из девяти малых смесей и формировали «большие» смеси. При положительном результате исследования «большой» смеси методом ОТ-ПЦР сначала исследовали все «малые» смеси, которые входили в эту «большую» смесь, а потом исследовали все индивидуальные образцы крови, входившие в «малые» смеси с положительным результатом ОТ-ПЦР на РНК ВИЧ (JAMA 2002; 288:216). Все положительные результаты подтверждались дополнительными исследованиями. В Северной Каролине применение этого протокола занимало 14 дней; стоимость исследования одного образца составляла 2,01 долл. Этот протокол использовался для прослеживания контактов по ВИЧ-инфекции и, возможно, способствовал профилактике передачи ВИЧ, поскольку острая ВИЧ- инфекция характеризуется высоким риском передачи ВИЧ (J Infect Dis 2005; 191:1403). В ходе применения этого протокола в Северной Каролине в течение года было обследовано 109 250 человек, из которых 606 были серопозитивны, а у 23 была обнаружена острая ВИЧ- инфекция.
  • Прогноз. Вирусная нагрузка коррелирует со скоростью снижения количества лимфоцитов CD4 (J Infect Dis 2002; 185:908), однако эта зависимость не такая сильная, как считалось ранее (JAMA 2006; 296:1523). Зависимость течения заболевания от вирусной нагрузки наиболее всесторонне изучалась в ходе исследования сохраненных образцов сывороток крови испытуемых, участвовавших в Многоцентровом когортном исследовании СПИДа (MACS). Была продемонстрирована стойкая взаимосвязь между «равновесной точкой» вирусной нагрузки и скоростью клинического прогрессирования ВИЧ- инфекции, при этом последняя не зависела от исходного количества лимфоцитов CD4 (Ann Intern Med 1995; 122:573; Science 1996; 272:1167; J Infect Dis 1996; 174:696; J Infect Dis 1996; 174:704; AIDS 1999; 13:1305; N Engl J Med 2001; 349:720; AIDS 2002; 16:2455; Lancet 2003; 362:679; J Acquir Immun Defic Syndr 2005; 38:289). В эпоху ВААРТ эта зависимость потеряла актуальность, сейчас исход заболевания определяется эффективностью проводимой терапии независимо от величины исходной вирусной нагрузки (AIDS 2006; 20:1197; Clin Infect Dis 2006; 42:136; J Infect Dis 2004; 190:280).
  • Риск развития оппортунистических инфекций. Оказалось, что у пациентов с количеством лимфоцитов CD4 -1 показатель вирусной нагрузки позволяет прогнозировать риск оппортунистических инфекций независимо от количества лимфоцитов CD4 (JAMA 1996; 276:105; AIDS 1999; 13:341; AIDS 1999; 13:1035; J Acquir Immune Defic Syndr 2001; 27:44). ACTG 722 было единственным проспективным исследованием, в котором изучалась эта связь. Было показано, что если у пациентов с количеством лимфоцитов CD4 -1 не удается снизить вирусную нагрузку на ?1 log10/мл, риск оппортунистических инфекций возрастает в 15 раз (J Acquir Immune Defic Syndr 2002; 30:154). Ретроспективный анализ историй болезни более чем 12 000 пациентов показал, что количество лимфоцитов CD4 — лучший прогностический показатель риска развития состояний и заболеваний, включенных в диагностические критерии СПИДа (Lancet 2002; 360:119), но именно вирусная нагрузка позволяет предсказать скорость снижения количества лимфоцитов CD4 (J Infect Dis 2002; 185:908).
  • Вероятность передачи ВИЧ. Вероятность передачи ВИЧ при практически любом виде контакта находится в прямой зависимости от уровня вирусной нагрузки (N Engl J Med 2000; 342:921; J Acquir Immune Defic Syndr 1996; 12:427; J Acquir Immune Defic Syndr 1998; 17:42; J Acquir Immune Defic Syndr 1999; 21:120; J Infect Dis 2002; 185:428; Lancet 2001; 357:1149; AIDS 2001; 15:621; Clin Infect Dis 2002; 34:391; J Infect Dis 2005; 191:1403; AIDS 2006; 20:895).
  • Наблюдение за эффективностью терапии. После начала терапии наблюдается быстрое снижение уровня РНК ВИЧ в течение 1–4 не- дель (альфа-спад), отражающее действие лекарственных препаратов на ВИЧ — как на свободные вирионы ВИЧ в плазме, так и на ВИЧ в первично инфицированных лимфоцитах CD4. За этим следует второе снижение вирусной нагрузки (бета-спад), оно более длительное (месяцы) и менее выраженное (см. количественные показатели ниже, в разделе «Частота лабораторных обследований при наблюдении за эф- фективностью терапии»). Бета-спад отражает эффективность противовирусного действия препаратов на зараженные ВИЧ макрофаги и ВИЧ, высвобождающийся из других резервуаров, особенно дендритных клеток лимфатических фолликулов, которые захватывают ВИЧ. Максимальный противовирусный эффект ожидается через 4–6 месяцев. Считается, что вирусная нагрузка — самый важный «барометр» эффективности терапии, хотя лучшим прогностическим показателем клинического прогрессирования ВИЧ-инфекции служит количество лимфоцитов CD4 (N Engl J Med 1996; 335:1091; Ann Intern Med 1996; 124:984; J Infect Dis 2002; 185:178). В ходе исследований нуклеотидных последовательностей клонов ВИЧ было установлено, что при уровне вирусной нагрузки менее 50 копий/мл не происходит формирования резистентных штаммов вируса — это наиболее важный аргумент в пользу необходимости поддержания вирусной нагрузки на этом уровне в течение как можно более длительного времени (J Infect Dis 2004; 189:1452; J Infect Dis 2004; 189:1444). С практической точки зрения на этом уровне не происходит репликации вируса и вероятность возникновения резистентности очень мала.
  • Неожиданно низкая вирусная нагрузка. У очень небольшого числа пациентов в течение длительного времени вирусная нагрузка сохраняется на низком уровне, а количество лимфоцитов CD4 остается стабильно высоким; таких пациентов называют «длительными непрогрессорами». Еще более редко встречаются «элитные супрессоры», у которых вирусная нагрузка стабильно держится ниже 50 копий/мл без антиретровирусной терапии (J Exp Med 2006; 203:1357). Стандартные методы определения вирусной нагрузки дают наиболее точные результаты для ВИЧ подтипа В, однако также одобрены FDA для количественного определения РНК ВИЧ подтипов A–G. В ходе исследования, в котором изучались возможности применения различных тест-систем для определения вирусной нагрузки в случае инфицирования не-В- подтипами ВИЧ, было установлено, что частота случаев необнаружения ВИЧ или расхождения результатов более чем на 1 log10 копий/мл для Amplicor Monitor 1.5 составила 3%, для Versant 3.0 — 9%, и для NucliSens — 15% (J Clin Microbiol 2005; 43:3860). Тест-системы для определения вирусной нагрузки для ВИЧ-2 (концентрации РНК ВИЧ-2) нет.
  • Резервуары ВИЧ в организме. ВИЧ способен сохраняться в некоторых тканях и клетках организма человека, в которых концентрация антиретровирусных препаратов может сильно отличаться от концентрации в плазме крови. Такие резервуары служат «хранилищем» для резистентных штаммов ВИЧ, откуда при соответствующих условиях они могут распространяться по всему организму. Основной резервуар — это латентные («спящие») клетки иммунной системы, несущие рецептор CD4; также ВИЧ сохраняется в ЦНС и половых путях (AIDS 2002; 16:39; J Clin Microbiol 2000; 38:1414).
Рекомендации

Приведены из клинических стандартов Американского отделения Международного общества борьбы со СПИДом (IAS-USA) (JAMA 2006; 296:827) и Министерства здравоохранения и социальных служб США (DHHS) (www.aidsinfo.nih.gov/guidelines).

  • Гарантия качества. Вирусную нагрузку рекомендуется измерять на фоне стабильного клинического состояния, не ранее чем через 4 недели после вакцинации или перенесенной инфекции, всегда одним и тем же методом в одной и той же лаборатории.
  • Частота лабораторных обследований при наблюдении за эффективностью терапии. После двукратного измерения исходного уровня вирусной нагрузки контрольные измерения следует проводить регулярно, каждые 3–4 месяца (Clin Infect Dis 2001; 33:1060). В начале лечения и после его коррекции вирусную нагрузку измеряют через 1–4 недели (альфа-спад), затем через 12–16 недель и 16–24 недели. Об эффективности лечения свидетельствует снижение вирусной нагрузки на 0,75–1,0 log10 копий/мл от исходной через 1 неделю (Lancet 2001; 358:1760; J Acquir Immune Defic Syndr 2002; 30:167), снижение на 1,5–2 log10 копий/мл (до Интерпретация результатов. Значимыми считаются изменения уровня РНК ВИЧ на ?50% (на 0,3 log10 копий/мл).
  • На основании уровня вирусной нагрузки в крови нельзя судить о степени повреждения функции иммунной системы, способности популяции лимфоцитов CD4 к восстановлению, чувствительности вируса к антиретровирусным препаратам, вирулентных свойствах вируса, его способности к репликации и к образованию синцития из инфицированных клеток, а также о вирусной нагрузке в других тканях (например, в лимфатических узлах, в ЦНС, в ЖКТ, в выделениях из половых путей).
  • Факторы, повышающие вирусную нагрузку:
    • смена доминирующего штамма ВИЧ, когда вирус, не способный образовывать синцитий (использующий в качестве корецептора хемокиновый рецептор CCR5), вытесняется вирусом, способным образовывать синцитий (использующим в качестве корецептора хемокиновый рецептор CXCR4);
    • прогрессирование ВИЧ-инфекции;
    • неудача антиретровирусного лечения из-за недостаточной противовирусной активности препаратов, недостаточных концентраций препаратов в организме, несоблюдения режима лечения и резистентности вируса;
    • суперинфекция ВИЧ (J Infect Dis 2005; 192:438);
    • острые инфекционные заболевания: на фоне активной формы туберкулеза вирусная нагрузка повышается в 5–160 раз (J Immunol 1996; 157:1271); на фоне пневмококковой пневмонии вирусная нагрузка повышается в 3–5 раз;
    • прививки, в том числе введение противогриппозной вакцины и вакцины Pneumovax (против Streptococcus pneumoniae) (Blood 1995; 86:1082; N Engl J Med 1996; 335:817; N Engl J Med 1996; 334:1222). В этом случае повышение вирусной нагрузки небольшое и сохраняется от 2 до 4 недель.
  • Относительные преимущества различных тест-систем. У тестсистемы Versant 3.0 хорошая воспроизводимость результатов для вирусных нагрузок в диапазоне 75–500 000 копий/мл. Линейный диапазон для суперчувствительной тест-системы Amplicor составляет 50– 100 000 копий/мл. Эту тест-систему не следует использовать при обследовании пациентов, у которых ожидается более высокая вирусная нагрузка (J Clin Microbiol 2000; 38:2837). У метода NucliSens более широкий динамический диапазон (176–3 500 000 копий/мл), и его можно использовать для измерения количества вируса как в крови, так и в других биологических жидкостях и тканях, например, в семенной жидкости, спинномозговой жидкости, грудном молоке, слюне и вагинальных выделениях (J Clin Microbiol 2000; 38:1414).

Таблица 2.5. Сравнительная характеристика лицензированных FDA тест-систем, основанных на разных методах измерения вирусной нагрузки

  Roche Bayer bioMerieux
Контактный телефон 800-526-1247 800-434-2447 800-682-2666
Торговое название Amplicor HIV Monitor 1.5 Versant HIV-1 RNA 3.0 NucliSens HIV-1 QT
Техника ОТ-ПЦР рДНК NASBA
Сравнение результатов Результаты, получаемые методом ОТ-ПЦР, сопоставимы с результатами, получаемыми методом рДНК (Versant) с использованием тест-систем 2.0 и 3.0 Результаты, получаемые методом рДНК, сопоставимы с результатами, получаемыми методом ОТ-ПЦР (Amplicor) Результаты, по-видимому, сопоставимы с результатами, получаемыми методами ОТ-ПЦР и рДНК, но пока не получено достаточно данных
Преимущества и недостатки Меньше ложноположительных результатов у ВИЧ-отрицательных пациентов по сравнению с методом рДНК Выполнение исследования занимает меньше времени у лаборанта. Хороший динамический диапазон, но выше порог определения вирусной нагрузки Может применяться для обнаружения вируса в тканях и биологических жидкостях, например, выделениях половых путей. Самый большой динамический диапазон.
Динамический диапазон Стандартный (Amplicor 1.5): 400–750 000 копий/мл
Суперчувствительный (Ultra-Direct 1.5): 50–100 000 копий/мл
рДНК 3.0: 75–500 000 копий/мл* NucliSens HIV-1 QT: 176–3 500 000 копий/мл; динамический диапазон зависит от объема
Подтип вируса Тест-система 1.5: от A до G от A до G от A до G
Необходимый объем материала для исследования Amplicor: 0,2 мл Суперчувствительный: 0,5 мл 1 мл От 10 мкл до 2 мл
Пробирки ЭДТА (пробирка с сиреневой крышкой) ЭДТА (пробирка с сиреневой крышкой) ЭДТА, гепарин, цельная кровь, любая биологическая жидкость, МКПК, семенная жидкость, ткани и т. д.
Требования Отделить плазму не позже чем через 6 часов после забора крови, перед транспортировкой заморозить при температуре –20°С или –70°С. Отделить плазму не позже чем через 4 часа после забора крови, перед транспортировкой заморозить при температуре –20°С или –70°С. Отделить сыворотку или плазму не позже чем через 4 часа после забора крови, перед транспортировкой заморозить при температуре –20°С или –70°С.

* Нижнее пороговое значение вирусной нагрузки, установленное FDA, составляет 75 копий/мл. За пределами США нижнее пороговое значение вирусной нагрузки составляет 50 копий/мл.

Источник: www.eurasiahealth.org

Напишите нам