Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Наиболее доступным, распространенным и сравнительно дешевым методом диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ (ИФА). Для исследования используют сыворотку и плазму.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) является наиболее популярным при диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых болезней человека. Метод удобен для выполнения большого числа однотипных исследований. В отличие от классических диагностических методов, основанных на агглютинации, преципитации, в ИФЛ на первом этапе происходит образование комплекса антиген-антитело, который затем проявляется с помощью фермент - субстратной реакции (7).

Разработано несколько модификаций ИФА: прямой, непрямой, конкурентный, блокирования, при этом один из специфических реагентов иммобилизуется на твердой фазе, затем последовательно добавляют исследуемую сыворотку, коньюгат, хромоген, проводя после каждой инкубации промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Результаты регистрируют с помощью многоканального спектрофотометра и проводят сравнение с контрольными образцами.

В качестве твердой фазы используют различные полимерные материалы: полистирол, поливинил, полиамид, полипропилен, а также сефарозу, желатин, пористые мембраны из нитроцеллюлозы. Твердая фаза может иметь форму планшетов, пробирок, шариков. Чувствительность анализа определяется природой гвердои фазы и гидрофобпостью специфического резгента. В большинстве применяемых тест-систем в производственных условиях иммобилизуют антигены трех типов: лизаты ВИЧ-инфицированных клеток, рекомбинантные белки вириоиов, синтетические белки ВИЧ. Антигены должны быть максимально очищены, т.к. специфичность тест-систем, в первую очередь, зависит от чистоты иммобилизованного белка.

Лизатные тест-системы относятся к тестам первого поколения, с их помощью выявляются все присутствующие антитела, но они обладают гиперчувствительностью и дают большое количество ложноположительных результатов. В рекомбинантных тестах используют белки ВИЧ, полученные в прокариотах, за счет встраивания отдельных генов ВИЧ, отвечающих за синтез диагностически значимых белков. Обычно в рекомбинантных тест-системах используют два - три белка ВИЧ, например: GP 120, GP 41, Р 24. Эти тест-системы более специфичны, чем лизатные, но менее чувствительны.

В пептидных тест-системах используют синтетические пептиды ВИЧ, полученные путем биохимического синтеза высококонсерватнвных зпитопов ВИЧ.

Чаше всего это белки генов env, и в силу этого пептидные тест-системы высоко специфичны, по обладают меньшей чувствительностью по сравнению с лизатными тестами. Существуют зарубежные тесты, иммуносорбенты которых содержат комплекс лизатных, рекомбинантных, пептитных антигенов.

Диагноз ВИЧ - инфекции основывается, прежде всего, на выявлении антител к ВИЧ. Серологические тесты для выявления антител к ВИЧ подразделяются на скрининговые тесты и подтверждающие (конфирматорные) тесты.

Большинство известных скрининговых тестов являются тестами с применением метода иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет одновременно, в течение одного рабочей) цикла, исследовать большое количество (не менее 90 на 1 планшете) образцов сывороток или плазмы крови человека.

Известны 3 генерации тестов в зависимости от характеристики применяемых антигенов и коньюгатов в ИФА.

Тесты 1-ой генерации основаны на использовании для сенсибилизации планшет (приготовление иммуносорбента) атигена ВИЧ, представляющего собой очищенный лизат ВИЧ, выращенного в культуре клеток лимфоцитов человека. Такие тесты были первыми при разработке диагностических тест-систем. Как показала практика, тест-системы с использованием вирусного лизата обладали недостаточной чувствительностью и специфичностью.

Тесты 2-ой генерации основаны на применении в качестве антигенов ВИЧ рекомбинантных белков и или синтетических пептидов,соотвестсвующих наиболее антигенно-функциональным эпитолам ВИЧ-qp 160/120, qp41, р55, р24 и т.д. Как правило, для сорбции планшет используется комбинация рекомбинантных и/или пептидных синтетических антигенов соответствующих ВИЧ типов 1 и 2.

Для тестов 2-ой генерации очень часто в качестве коньюгатов применяются моноклональные пероксидазные конъюгаты к иммуноглобулинам человека класса Ми классаG.

Тесты 3-ей генерации - являются сендвич-ИФА, когда для получения конъюгата применяется та же комбинация антигенов ВИЧ типов 1 и 2, которая используется для сорбции планшет, но в этом случае -меченая пероксидазой хрена.

Применение коньюгатов к иммуноглобулинам класса М и конъюгатов антигена ВИЧ+ пероксидаза направлено из повышение чувствительности ИФА-тестов, на выявление антител любой природы, в первую очередь ранних антител (класса М), которые появляются значительно раньше антител класса G (до 6 недели после ВИЧ инфицирования), однако их циркуляция в крови достаточно кратковременная.

В настоящее время разработаны тесты 4-ой генерации, в которых в различной комбинации применяются антигены ВИЧ (рекомбинантные и/или пептидные), а также, помимо этого, как в иммуносорбенте, так и в конъюгатах применяются моноклональные антитела к р24- белку сердцевины ВИЧ (qaq), который появляется на самой ранней стадии ВИЧ-инфекции, когда антител к ВИЧ нет - период от 0 до 6 недель, который называют периодом «серологического окна». Тесты 4-ой генерации направлены на выявление не только антител (М и G) к ВИЧ, но и антигена ВИЧ р 24.

Таким образом, эти тесты предназначены для ранней диагностики ВИЧ-инфекиии. Кроме тестов непрямого ИФА и сендвич ИФА разработано большое количество простых, не требующих специального оборудования тестов,таких как агглютинация, иммунофильтрация. иммунохроматография, и т.д. В зависимости от времени постановки теста они подразделяются на быстрые (экспресс-тесты) и простые. Наборы для постановки этих тестов обеспечены готовыми к применению реагентами, капельницами. Исследуемые сыворотки или плазма используются, как правило, в неразведенном виде.

Положительный результат исследования проявляется в виде окрашенного пятна или линии, в виде агглютинации эритроцитов или частиц латекса. Такие тесты особенно пригодны в лабораториях, которые лимитированы оборудованием и исследуют ежедневно небольшое количество образцов сыворотки или плазмы крови человека.

В мире в настоящее время более 40 фирм выпускают более 100 наименований скрининговых тест-систем. К настоящему времени ВОЗ рекомендовано три стратегии тестирования антител к ВИЧ, которые направлены к максимальной информативности тестирования при минимально возможной стоимости анализа. Каждая стратегия тестирования основывается на показателе распространения ВИЧ-инфекции среди населения на конкретной территории той или иной страны.

Во всех случаях обследования крови в организациях переливания крови или трансплантации органов следует применять стратегию №1.

При мониторинге населения на наличие ВИЧ-инфекции при показателе > 10% - стратегия №1, при показателе < 10% - стратегия №2.

При постановке диагноза ВИЧ в случае клинических признаков ВИЧ/ симптомов ВИЧ при показателе > 30%- стратегия №1,при показателе <= 30% -стратегия №2. При отсутствии симптомов ВИЧ при показателе > 10% — стратегия №2, при показателе - 10% - стратегия №3.

Стратегия №1

Все образцы сывороток плазмы тестируются в ИФА или в простом/ быстром тесте. Реактивные сыворотки обозначаются как положительные, содержащие антитела к ВИЧ, нереактивные - как отрицательные, не содержащие антитела к ВИЧ. Позитивные на ВИЧ сыворотки верифицируются в иммуноблоте. При обследовании доноров крови или органов предпочтение следует отдавать комбинированным ВИЧ -1. ВИЧ 2 тестам с выявлением ВИЧ-антител и ВИЧ-антигена с наиболее высокой чувствительностью. В таком случае доноры, образиы сывороток которых оказались реактивными при первичном обследовании в наиболее чувствительном ИФА-тесте, должны быть отклонены от донорства.

При мониторинге населения на ВИЧ чувствительность ИФА тестов должна быть не менее 95%.

Стратегия №2.

Все образцы сыворотки/плаз мы крови первично тестируются в ИФА-тесте или в простом/быстром тесте. Первично реактивные (позитивные) образцы тестируются повторно в ИФА-тесте или быстром/простом тесте, основанных на других антигенах (вместо рекомбинантных - пептидные и наоборот) или в тестах, полученных по принципиально другой технологии. Повторно реактивные образцы обозначаются как положительные, содержащие антитела к ВИЧ. Нереактивныс образцы признаются отрицательными. Образцы сывороток, реактивные в первичном тесте, но нереактивные при повторном тестировании - должны быть ретестированы в двух различных ИФА-тестах. Если получены противоречивые (конкордантные) результаты в двух ИФА тестах, сыворотка признается как неопределенная. Все неопределенные результаты должны быть зафиксированы и должны анализироваться отдельно в отчетах, а пациенты, от которых получены такие образцы, должны быть взяты под наблюдение для последующего обследования.

Стратегия №3

Так же. как при стратегии № 2, все сыворотки первично тестируются в ИФА-тест-системе или в простом/быстром тесте, реактивные (позитивные) образцы тестируются повторно в другой тест-системе. Первично нереактивные сыворотки обозначаются как ВИЧ-отрицательные. Сыворотки реактивные при первичном тестировании, но нepeактивные при повторном исследовании, должны быть исследованы еще раз в обеих тест-системах. Стратегия № 3 требует третьего исследования, если сыворотка выявлена реактивной при первичном и повторном исследовании в одной и той же тест-системе. Третий тест при этом в обязательном порядке должен основываться на тест-системе с другими антигенами или на тест-системе, полученной принципиально другой технологией. Сыворотка, реактивная в 3 тесте, обозначается как ВИЧ-позитивная.

Сыворотка, реактивная при первичной и вторичной постановке, но не реактивная при третьем исследовании, обозначается как неопределенная.

Сыворотка, реактивная при первичном исследовании, но не реактивная во втором и третьем исследовании, также обозначается как неопределенная для пациентов, которые имели контакт по ВИЧ в последние 3 месяца и как отрицательная для пациентов, которые не имели какого бы то ни было риска заражения ВИЧ.

У всех пациентов, которые имели серопозитивные результаты при исследовании первого образца сыворотки крови, следует получить дополнительный образец сыворотки крови для повторного тестирования, чтобы избежать технических или случайных ошибок.

Неопределенные результаты исследования сыворотки крови могут быть получены у ВИЧ-пациентов, имеющих III или IV стадию СПИДа (по критериям ВОЗ).

У пациентов, не имеющих симптомов ВИЧ-инфекции, при неопределенных результатах исследования сыворотки крови необходимо исследовать второй образец сыворотки крови, полученный не ранее, чем через 2 недели после первого образца крови. В случае получения неопределенного результата при обследовании второго образца крови, необходимо провести исследование его в подтверждающем тестe. При этом если неопределенный результат подтверждается через 3, 6, 12 месяцев, пациента следует признать ВИЧ-отрицательным.

Таким образом, стратегия №1 применяется только для подтверждения клинического диагноза ВИЧ-пациентов на III или IV стадии CПИДа и когда ВИЧ-инфекция регистрируется более чем у 30% населения региона. При более низких показателях распространения ВИЧ для постановки серологического диагноза) пациентов III-IV стадий СПИДа используют стратегию №2.

При выборе тестов для выявления ВИЧ-антител для использования в стратегиях №2 и №3 для первичною тестирования следует использовать тест-систему с наиболее высокой чувствительностью, тогда как при втором и третьем исследовании тест-системы должны быть с более высокой специфичностью, чем при первичном исследовании образца сыворотки крови.

В Российской Федерации 9 предприятий выпускают 15 наименований иммуноферментных тест-систем дли выявления антител к ВИЧ 1 и 2 типов.

Большинство тест-систем являются препаратами 2 генерации, т.е. в качестве иммуносорбента используются комбинации рекомбинантных белков или синтетических пептидов, соотвествуюших наиболее антигеноактивным участкам ВИЧ 1 и 2 типа. В качестве конъюгатов используются моноклональные или поликлональные антитела к иммуноглобулинам человека класса М и G.

Тест-системы 2-ой генерации: «Скрнн-ВИЧ»; «Рекомбинант-ВИЧ 1+2», «Эколаб-тест ВИЧ 1.2»;«РекомбиБест»-антиВИЧ 1-2;»,«Амеркардапти ВИЧ 1/2"; "Пептоскрин -2", "ВИЧ-1, ВИЧ-2-Авицеина".

В одной тест-системе в комбинацию антигенов ВИЧ включены рекомбинантные белки ВИЧ-1-0 группы: ИФЛ-анти-ВИЧ Униф".

Кроме того, разработаны и выпускаются 2 тест-системы 3 генерации, в которых в качестве коньюгата используются комбинации антигенов ВИЧ 1 и 2 типов, меченые пероксидатой хрена: "Комби Бест-анти ВИЧ 1+2", "Рекомбинант ВИЧ1,2ДСМ"

Государственная приемка тест-систем при внедрении в практику, постоянная оценка качества каждой выпускаемой серии, регулярные сравнительные испытания (1 раз в 2 года) тест-систем, организуемые МЗ РФ, свидетельствуют о стабильном качестве отечественных препаратов, которые не уступают аналогичным препаратам 2 и 3 генерации зарубежного производства как по чувствительности, так и по специфичности.

Различные комбинации антигенов, различные конъюгаты и другие технологические приемы, используемые при производстве отечественных тест-систем, позволяют взаимозаменять их при обеспечении той или иной стратегии диагностики ВИЧ-инфекции. В РФ зарегистрированы две тест-системы 4 генерации зарубежного производства, которые наиболее эффективны при обследовании доноров крови и органов - наиболее опасных групп для распространения ВИЧ-инфекции -"Вироностика ВИЧ Униформ II Аг/Ат" фирмы "Органон-техника" (Голландия) и"Дженскрин плюс ВИЧ Аг/Ат" фирмы "Биорад" (Франция).

Эти тест-системы предназначены для одновременного качественного выявления антигена р 24 ВИЧ (ранний антиген ВИЧ) и антител к ВИЧ 1 и 2 типа классов М, A, G, т.е. направлены на максимальное сокращение "серологического" окна при ранней диагностики ВИЧ-инфекции.

Источник: АХ. Рахманова, Е.Н. Виноградова, Е.Е. Воронин, А. А. Яковлев "ВИЧ-инфекция"

Напишите нам