Большинство алгоритмов тестирования требует применения весьма специфических анализов, таких как Вестерн блот, непрямой анализ с использованием флуоресцирующих антител или радиоиммунопреципитация (РИП) для подтверждения положительных результатов, полученных в ходе скрининга. При правильном выполнении и интерпретации эти исключительно специфические анализы не должны давать биологических ложно-положительных результатов. Однако, они являются более трудоемкими и более дорогостоящими по сравнению с теми анализами, которые применяются для скрининга.
Эти подтверждающие анализы не должны быть разрешены FDA для применения в США, если они используются не для тестирования доноров крови, а для других целей. В случаев доноров используется лицензированный подтверждающий анализ для целей повторного использования доноров, когда результаты тестирования должны быть отрицательными. Основная задача подтверждающих анализов заключается в том, что неинфицированные лица, дающие положительный результат по данным скрининга, не идентифицируются ошибочно как лица, инфицированные ВИЧ.
Методология
Вестерн блот представляет собой вероятно наиболее широко применяемый подтверждающий анализ для выявления антител к ретровирусам; большинство авторитетных исследователей в этой области считают его "золотым стандартом" для подтверждения результатов в отношении ВИЧ. Метод основан на использовании электрофореза для разделения антигенов ВИЧ, полученных из лизата вируса, выращенного в культуре. Это позволяет денатурировать компоненты вируса, придает им отрицательный заряд и разделяет их преимущественно на основании молекулярного веса. Разделение антигенов позволяет выявлять специфические антитела к каждому из антигенов вируса в ходе последующего набора этапов, являющегося сходным с методологией иммуноферментного анализа.
Смесь очищенных антигенов ВИЧ наносят на блок геля, содержащего додецилсульфат натрия и полиакриламид, после чего проводится электрофорез. Вирусные белки (антигены ВИЧ) мигрируют через молекулярные поры геля со скоростями, которые определяются электрическим зарядом и молекулярным весом; более высокомолекулярные белки мигрируют на меньшее расстояние и образуют полосу, находящуюся ближе к точке старта. Белки, разделенные в геле, затем переносят (осуществляется их "блоттинг") на нитроцеллюлозу с помощью другой процедуры электрофореза. Нитроцеллюлозная мембрана разрезается на тонкие полоски, каждая из которых содержит полное распределение полос антигенов, соответствующих вирусным белкам. Индивидуальная тест полоска инкубируется с разведением исследуемого образца или контроля (1:50 ил 1:100), после чего отмывается и инкубируется с меченым глобулином против антител человека. В этот момент процедура становится подобной процедурам любого непрямого иммуноанализа. Меткой обычно является фермент (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза), который реагирует со специфическим бесцветным субстратом с образованием нерастворимого окрашенного вещества (окрашенной полосы на полоске) в тех местах, где присутствует комплекс антиген-антитело. Реакция с положительным образцом сыворотки дает набор полос на полоске, который характерен для ВИЧ. Многие из этих полос идентифицированы со специфическими продуктами вирусных генов.
Вирусные антигены ВИЧ-1 разделяются на следующие компоненты (сверху вниз): gp160, gp120, p66, p55, p51, gp41, p31, p24, p17 и p15.
Примеры Вестерн-блотов при анализе на ВИЧ-инфекцию. (1) Положительный контроль (сильный); (2) Положительный контроль (слабый); (3) Отрицательный (негативный) контроль; (4) Неопределенный результат; (5) Неопределенный результат (с высокой вероятностью положительного).
Обозначение "gp" относится к гликопротеидам; "p" означает белки. Цифры (x100) обозначают молекулярные веса. Важно помнить, что невирусные белки, происходящие из клеток хозяина, в которых выращивают вирус, также присутствуют на полоске нитроцеллюлозы. Они могут образовывать полосы во многих местах, однако чаще находятся вблизи средних значений молекулярного веса (40,000- 60,000). Наличие этих невирусных белковых полос может создавать трудности при интерпретации результатов за счет неспецифических реакций.
В зависимости от присутствующих в образце конкретных антител, реагирующих с разделенными антигенными компонентами, получаются разные профили полос. Тип профиля (комбинация и интенсивность присутствующих полос) определяет, является ли лицо, сыворотка которого анализируется, положительным в отношении антител к ВИЧ. Классификация результатов Вестерн блота определяется рядом критериев. Большинство учреждений в настоящее время следует рекомендациям Центра по контролю за заболеваниями (CDC), которые требуют для вывода о положительном результате наличия реагирования по крайней мере для следующих антигенов: p24, gp41, gp120/160. В настоящее время является общепринятым, что отрицательным результатом является отсутствием всех полос. Однако две организации, включая ВОЗ, придерживаются мнения, что результаты могут считаться отрицательными, если присутствует только очень слабая полоса p17. Вывод о неопределенных результатах делается, когда присутствует один или несколько антигенов, которые, однако, не удовлетворяют критериям для положительного результата. На Рис. 1 представлены примеры положительного, отрицательного и неопределенного результата Вестерн блота.
К сожалению, сыворотки ряда неинфицированных лиц показывают определенную способность к реагированию с одним или несколькими антигенами при анализе с помощью Вестерн блота. Такое реагирование может давать до 15% нормальных неинфицированных лиц, и это неоднократно происходит у лиц, которые оказываются отрицательными в результате применения методов скрининга. Соответственно, если сыворотки, дающие отрицательные результаты при использовании метода ИФА, тестируют с помощью Вестерн блота, многие из таких сывороток дают неопределенный результат. Большинство сывороток, дающих неопределенный результат, обнаруживают лишь слабую реакцию в отношении белков gag (обычно p17, p24 и/или p55); бывают и другие комбинации, но они являются нечастыми. Любая положительная реакция с использованием метода Вестерн блот, которая не отвечает требованиям, необходимым для вывода о положительном или отрицательном результате, должна считаться дающей неопределенный результат.
У некоторых лиц с неопределенными результатами (например, реакции с p24 и p55) впоследствии происходит сероконверсия; это свидетельствует о том, что наличие профиля, состоящего из p24 и p55, может быть индикатором ранней инфекции. Наоборот, у других лиц с аналогичным профилем, наблюдавшимся в течение длительных сроков (годы), сероконверсия никогда не происходила (т.е. они не являются инфицированными). По существу, большинство неопределенных результатов, получаемых при анализах Вестерн блот, связаны с неинфицированными лицами, которые дают профиль p24 и/или p55. Поэтому неопределенный результат Вестерн блота не может предсказывать ранние стадии инфекции.
Большинство авторитетных специалистов считает, что лица, дающие неопределенный результат, должны быть подвергнуты повторному анализу через несколько месяцев, хотя сероконверсия может быть обнаружена через более короткое время. Если это возможно, повторное тестирование в более поздний срок должно выполняться параллельно с повторным определением исходного образца в одном и том же опыте с одним и тем же набором и в одинаковых условиях определения, чтобы гарантировать возможность прямого сравнения образцов. Всемирная организация здравоохранения рекомендует повторное тестирование через 2 недели, если исходно получены "подозрительные профили" в Вестерн блотах, хотя другие организации рекомендуют подождать от 1 до 6 месяцев перед проведением повторного анализа. Если повторное тестирование выполняется в течение 6 месяцев и результаты становятся отрицательными или если не имеется прогрессии в отношении характера полос, инфекцию ВИЧ, как правило, можно исключить. Вследствие причин, которые остаются непонятными, у многих лиц неопределенные результаты сохраняются на протяжении многих лет, однако эти лица не являются инфицированными. Если имеет место серологическая прогрессия (большее число положительных полос или более интенсивные полосы) или имеет место конверсия к положительному результату (сероконверсия) при повторном анализе, то это означает, что соответствующее лицо было вероятно инфицировано на момент первого анализа (ранняя инфекция). Следует отметить, что лица, вакцинированные против ВИЧ (например, субъединицей gp160), могут неправильно выявляться как положительные на основании реакции только с антигенами оболочки вируса.
Значение неопределенного результата при анализе Вестерн блот варьирует в зависимости от факторов риска, клинического состояния больного и полученного профиля полос. Например, лица с поведением высокого риска в прошлом имеют большую вероятность сероконверсии в дальнейшем, поскольку вероятность их инфицирования является высокой. Кроме того, некоторые типы профилей Вестерн блота являются более надежными индикаторами ранней инфекции (например, наличие p24, p31 и p55), чем другие (например, только p17). Многие исходно неопределенные результаты, которые в последующем стали отрицательными или остаются неопределенными, вероятно являются результатом неспецифических реакций, гипергаммаглобулинемии, наличия перекрестно реагирующих антител, инфекции ВИЧ-2 или инфекции неизвестным, но родственным ретровирусом. По данным нескольких сообщений, аутоиммунные заболевания (например, системная красная волчанка) могут вызывать ложно-положительные результаты анализов на ВИЧ, включая анализ с помощью Вестерн блота (34). Важно отметить, что быстрые анализы, о которых мы говорим, легко выполняются, и они могут быть использованы в развивающихся странах. Также известно, что некоторые лица с заболеванием на стадии СПИДа могут терять реактивность в отношении р24, а возможно и антитела, реагирующие с другими белками вируса на более поздних стадиях заболевания, так что даже больные на стадии СПИДа могут давать по некоторым критериям неопределенные результаты при использовании Вестерн блота. При сомнительном диагнозе чтобы решить вопрос о том, как поступать с такими неопределенными результатами могут потребоваться дополнительные анализы, такие как ПЦР и культивирование вируса.
При использовании этой методики клетки (обычно лимфоциты) инфицируются ВИЧ и далее фиксируются на предметном стекле. Добавляют сыворотку, содержащую анти-ВИЧ антитела, которые реагируют с внутриклеточным ВИЧ. Предметное стекло промывают, после чего добавляют антитела к иммуноглобулинам человека с ковалентно связанной флуоресцентной меткой. Реакцию считывают с помощью флуоресцентного микроскопа. Эта методика имеет то преимущество, что иногда она дает возможность определения для образцов, которые давали неопределенные результаты в анализе Вестерн блот. Недостатки, связанные с ее использованием, включают необходимость дорогостоящего микроскопа и субъективную интерпретацию, что требует хорошо подготовленных специалистов.
Были разработаны анализы на основе Вестерн блот, которые дают возможность идентифицировать и дифференцировать инфекции, вызываемые ВИЧ-1 и ВИЧ-2. В большинстве таких анализов используются вирусные лизаты ВИЧ-1 и синтетические пептиды, которые имеют специфичность, соответствующую ВИЧ-2, и которые нанесены на одну и ту же полоску нитроцеллюлозы (модифицированный или усиленный Вестерн блот). В таком случае на полоске присутствуют множественные антигены ВИЧ-1 и одна полоса, специфичная для ВИЧ-2 (gp36 или gp41). Критерии фирм-производителей включают реагирование на один генный продукт из каждых трех основных групп (gag, pol, и env) для того, чтобы сделать положительное заключение относительно ВИЧ-1. Для вывода о реакции, положительной в отношении ВИЧ-2, должны быть зарегистрированы реакции на ВИЧ-2 специфический антиген плюс реакция на ВИЧ-1 специфический антигены, которые сами по себе не удовлетворяют критериям для положительного вывода относительно инфекции ВИЧ-1.
Другой альтернативой классическому Вестерн блоту, подтверждающему определение на основании Вестерн блот анализа, является "линейный" иммунный анализ (LIA). В этом методе рекомбинантный антиген или синтетический полипептидный антиген наносят на полоску нитроцеллюлозы, а не подвергают электрофорезу, как это делается при Вестерн блот анализе. Такое использование "искусственных" антигенов уменьшает наличие контаминирующих веществ из клеточной культуры, которые могут оказать мешающее воздействие и давать ложные реакции. Использование ЛИА распространено в Европе, однако на май 1997 г. эти анализы не были лицензированы для использования в США. В ряде сообщений было подтверждено, что точность этого анализа соответствует точности Вестерн блота.
"Тест-системы на ВИЧ-специфические антитела" Н. Константайн, Медицинская школа Университета Мэрилэнд
